牡蠣低聚肽對(duì)CTX誘導(dǎo)的PADAM大鼠性功能及生殖功能的干預(yù)作用

劉 瑜,張海欣,盛卓嫻,3,王 憬,陶雅浩,李國(guó)明,金其貫,*,劉文穎,*

(1.揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015;3.南京體育學(xué)院奧林匹克學(xué)院,江蘇南京 211162)

40歲后的男性隨著年齡增長(zhǎng)常感性欲、性頻率、陰莖勃起堅(jiān)硬程度有所降低,50～60歲后更為明顯,從而形成中老年男性雄激素部分缺乏綜合征(Partial androgen deficiency of aging male,PADAM)。PADAM又稱(chēng)為男性更年期綜合征,是指中老年男性體內(nèi)睪酮水平降低或者靶器官對(duì)睪酮或?qū)ζ浠钚源x產(chǎn)物敏感性隨著年齡的增長(zhǎng)而降低,出現(xiàn)以植物神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)生理功能紊亂為主的癥候群[1-5],主要表現(xiàn)為性欲減退、勃起功能障礙、精子活性降低、疲勞、注意力不集中、煩躁、易怒、甚至焦慮、抑郁等一系列癥狀和體征,嚴(yán)重影響患者的工作與生活質(zhì)量。雄激素替代療法是治療PADAM的主要方法,但是雄激素補(bǔ)充治療引起的紅細(xì)胞增多、前列腺增生以及前列腺癌的潛在影響也引起人們的密切關(guān)注,影響了雄激素補(bǔ)充治療的臨床應(yīng)用[5-9]。有研究發(fā)現(xiàn),許多營(yíng)養(yǎng)素與人類(lèi)的生殖功能、精子發(fā)生、雄激素合成與分泌都有一定的關(guān)系,特別是維生素E、維生素A、鋅和硒等微量元素[10]。

牡蠣(Oyster)俗稱(chēng)海蠣子,肉質(zhì)鮮美,含有豐富蛋白質(zhì)、氨基酸、牛磺酸、維生素和礦物質(zhì)等,具有增強(qiáng)免疫力、降血糖等功效,是第一批被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)列為藥食兩用的保健療效品,具有很好的食療價(jià)值[11-13],而且能增強(qiáng)男性雄激素的分泌,有補(bǔ)腎壯陽(yáng)作用[14-15]。而牡蠣低聚肽(Oyster oligopeptides,OOP)是對(duì)牡蠣蛋白進(jìn)行酶解、干燥,獲得分子量小于1000 Da的寡肽。由于寡肽可以不經(jīng)消化迅速被吸收,且比游離氨基酸吸收率更高,且寡肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)功能片段,因此OOP與自然牡蠣蛋白相比,不僅具有較高的生物活性,而且吸收率更高[16-17]。目前不少研究證實(shí)OOP可以增強(qiáng)雄性激素的分泌和男性的生殖功能。張亭等[18]研究發(fā)現(xiàn)OOP配伍核桃低聚肽和山藥多糖能顯著提高正常小鼠血清一氧化氮(NO)及睪酮含量,顯著增強(qiáng)性功能。張雪妍等[19]通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了牡蠣酶解產(chǎn)物及其超濾組分(<5 ku和5～10 ku)可有效增強(qiáng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3的增殖活性并促進(jìn)其分泌睪酮,且具有濃度依賴(lài)性。陳悅等[20]通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)小分子牡蠣多肽可通過(guò)提高正常小鼠黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)的分泌,增加睪丸類(lèi)固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、細(xì)胞色素P450 膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)和3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3β-HSD)的基因表達(dá),促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成和分泌,提高血清睪酮的含量,從而起到增強(qiáng)雄性小鼠交配能力、性功能的作用。最近,李大煒等[21]通過(guò)D-半乳糖建立衰老大鼠模型,發(fā)現(xiàn)高劑量牡蠣肽能顯著改善模型大鼠睪丸組織及精子質(zhì)量的衰老狀態(tài)。但是OOP能否有效地干預(yù)PADAM的形成目前尚未見(jiàn)到研究報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)雄性大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)建立PADAM大鼠模型[22],與此同時(shí)補(bǔ)充不同劑量的OOP,6周后觀察大鼠的性行為、精子性狀等指標(biāo)的變化,探討不同劑量的OOP對(duì)PADAM大鼠性功能和生殖功能的影響;同時(shí)觀察血清中FSH、LH、總睪酮(Total testosterone,TT)、游離睪酮(Free testosterone,FT)以及睪丸雄激素受體(Androgen receptor,AR)含量的變化,探討OOP干預(yù)性功能和生殖機(jī)能的生理機(jī)制,為OOP的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

OOP 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心提供,其主要成分:游離氨基酸占28.36%,肽含量占57.39%,其中分子量在1000 Da以下的有88.4%,3000 Da以下的占98.8%;CTX 江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857);苯甲酸雌二醇 杭州動(dòng)物藥品廠(獸藥字(2103)110202511);M199培養(yǎng)基 Sigma-Aldrich;血清TT、FT、LH、FSH和睪丸AR含量Elisa試劑盒 南京森貝伽生物科技有限公司;雄性和雌性SD大鼠,SPF級(jí) 上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,質(zhì)量許可證號(hào)為SCXK(滬)2013-0006。

精子、微生物動(dòng)(靜)態(tài)自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng) 清華同方;Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Thermo Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù)方案 SD大鼠雄性50只和雌性10只,體重180～220 g,分籠飼養(yǎng),每籠5只,室溫(25±2) ℃,每3天更換墊料。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC,n=10)、PADAM組(PC,n=10)、PADAM+低劑量OOP組(PLO,n=10)、PADAM+中劑量OOP組(PMO,n=10)、PADAM+高劑量OOP組(PHO,n=10)共5組。在實(shí)驗(yàn)期間每組喂飼普通飼料,PC、PLO、PMO、PHO 4組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)按照20 mg/(kg·d)的劑量腹腔注射CTX,連續(xù)5 d,復(fù)制PADAM大鼠模型[22]。與此同時(shí),PLO組每天灌服0.5 g/kg·bw OOP,PMO組每天灌服1.2 g/kg·bw OOP,PHO組每天灌服2.0 g/kg·bw OOP[23],共6周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)取材 動(dòng)物在末次灌胃結(jié)束后的第二天上午取材,在取材前斷食不斷水8 h,每只腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉,然后從腹主動(dòng)脈取血5 mL,放入試管中,靜置60 min 后4000 r/min離心15 min,分離的血清保存于-80 ℃冰箱,用于測(cè)定血清TT、FT、LH、FSH含量。取左側(cè)睪丸制備10%組織勻漿用于測(cè)定睪丸AR含量,取左側(cè)附睪,用于測(cè)定精子性狀。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 各組大鼠性行為的測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)取材前1周,參照楊菊[24]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行大鼠性行為實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前48 h給雌性大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(0.02 mg/只),使之處于動(dòng)情期。在晚上7～11時(shí)測(cè)定雄性大鼠的性行為,將雄性大鼠單獨(dú)放入鼠籠中5 min以適應(yīng)環(huán)境,然后每籠放入雌性大鼠1只,觀察并記錄從雌鼠投入至雄鼠首次捕捉雌鼠的時(shí)間(捕捉潛伏期)、雄鼠首次與雌鼠交配的時(shí)間(交配潛伏期)以及20 min內(nèi)雄鼠捕捉雌鼠和發(fā)生交配的次數(shù)。

1.2.3.2 精子性狀的測(cè)定 取部分附睪尾準(zhǔn)確稱(chēng)重后,置于含有4 mL 預(yù)溫37 ℃的M199培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用手術(shù)剪刀剪破被膜,放入37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育5 min,用尖頭鑷子移出殘余組織,緩慢搖動(dòng)培養(yǎng)皿,使精子懸液混勻[25-26]。吸取30 μL的精子懸液至預(yù)溫的細(xì)胞計(jì)數(shù)板中,用精子、微生物動(dòng)(靜)態(tài)自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行攝像后觀察和計(jì)算精子數(shù)量、精子活率及精子密度。其中精子數(shù)量(個(gè)/mg)=液體精子密度(個(gè)/mL)× 4(mL)/稱(chēng)取附睪重(mg),精子活力=前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/總精子數(shù)×100,精子活率=(前向運(yùn)動(dòng)+橫向擺動(dòng)精子)/總精子數(shù)×100。

1.2.3.3 血清TT、FT、LH、FSH和睪丸AR含量測(cè)定 血清TT、FT、LH、FSH和睪丸AR含量采用Elisa測(cè)定,嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠性行為的變化

如表1所示,與NC相比,PC組捕捉潛伏期有極顯著性延長(zhǎng)(P<0.01),捕捉次數(shù)雖有所減少,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與PC組相比,PLO、PMO和PHO組捕捉潛伏期均極顯著性縮短(P<0.01),捕捉次數(shù)均極顯著性增加(P<0.01);PLO、PMO和PHO組之間捕捉潛伏期和捕捉次數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠捕捉潛伏期和捕捉次數(shù)的變化

如表2所示,與NC組相比,PC組交配潛伏期顯著性延長(zhǎng)(P<0.05),且交配次數(shù)顯著性減少(P<0.05),從而說(shuō)明,在CTX誘導(dǎo)大鼠形成PADAM時(shí),伴隨著性功能的降低。與PC組相比,PLO組交配潛伏期有所縮短,但無(wú)顯著性差異(P>0.05),而交配次數(shù)有極顯著性增多(P<0.01);PMO和PHO組交配潛伏期均極顯著或顯著短于PC組(P<0.01、P<0.05),交配次數(shù)均極顯著性增多(P<0.01)。與PLO組相比,PMO和PHO組交配潛伏期有所縮短,但無(wú)顯著性差異(P>0.05),而交配次數(shù)均極顯著性增多(P<0.01)。PMO和PHO組之間交配潛伏期和交配次數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從而說(shuō)明在CTX誘導(dǎo)大鼠形成PADAM時(shí)補(bǔ)充不同劑量的OOP可以明顯改善大鼠的性功能,且以中、高劑量的OOP效果較好。

表2 各組大鼠交配潛伏期和交配次數(shù)的變化

2.2 各組大鼠精子性狀的變化

如表3所示,與NC組相比,PC組精子數(shù)量顯著性減少(P<0.05),精子活率和精子活力顯著或極顯著性降低(P<0.01、P<0.05),從而說(shuō)明在CTX誘導(dǎo)大鼠形成PADAM時(shí),生殖功能也顯著降低。與PC組相比,PLO組精子數(shù)量、精子活率和精子活力均有所增加,但無(wú)顯著性差異(P>0.05),雖然PMO組精子數(shù)量無(wú)顯著性增加(P>0.05),但精子活率和精子活力均顯著或極顯著性增加(P<0.01、P<0.05);PHO組精子數(shù)量、精子活率和精子活力均極顯著性增加(P<0.01);在PLO、PMO和PHO組之間,除了PHO精子活率顯著高于PLO組之外(P<0.05),精子數(shù)量和精子活力隨著OOP補(bǔ)充劑量的增加有增加趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從而說(shuō)明在CTX誘導(dǎo)大鼠形成PADAM時(shí)補(bǔ)充不同劑量的OOP可以改善大鼠的生殖功能,且以中、高劑量的OOP效果較好。

表3 各組大鼠精子性狀的變化

2.3 各組大鼠血清TT和FT含量的變化

如表4所示,與NC組相比,PC組血清TT和FT均有極顯著性降低(P<0.01),從而說(shuō)明小劑量的CTX可導(dǎo)致血清睪酮含量的顯著降低,可成功誘導(dǎo)大鼠PADAM的形成。與PC組相比,PLO組血清TT和FT含量有所增加,但無(wú)顯著性差異(P>0.05),PMO組和PHO組血清TT(P<0.01)和FT(P<0.01,P<0.05)含量均顯著性增加。與PLO組相比,PMO和PHO組血清TT均顯著性增加(P<0.05,P<0.01),而血清FT含量有增加趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(P>0.05);與PMO組相比,PHO組血清TT和FT含量均無(wú)顯著性增加(P>0.05)。從而說(shuō)明,補(bǔ)充中、高劑量的OOP對(duì)CTX誘導(dǎo)大鼠PADAM的形成具有顯著的干預(yù)作用。

表4 各組大鼠血清TT和FT含量的變化

2.4 各組大鼠血清FSH、LH和睪丸AR含量的變化

如表5所示,與NC組相比,PC組血清LH含量和睪丸AR含量顯著性降低(P<0.01,P<0.05),從而說(shuō)明在CTX誘導(dǎo)PADAM形成過(guò)程中,垂體分泌LH顯著減少是睪丸睪酮合成和分泌減少的重要原因,與此同時(shí)伴隨著睪丸AR表達(dá)的降低,從而引起精子數(shù)量的減少以及精子活率和精子活力的降低。與PC組相比,PLO組血清FSH、LH和睪丸AR含量無(wú)顯著性增加(P>0.05),而PMO和PHO組血清FSH(P<0.01)、LH(P<0.05,P<0.01)和睪丸AR(P<0.01)含量均顯著性升高;與PLO組相比,PMO血清FSH含量極顯著性增加(P<0.01),PHO組血清FSH、LH和睪丸AR含量均顯著性增加(P<0.01,P<0.05,P<0.05);與PMO組相比,PHO組血清FSH、LH和睪丸AR含量有增加的趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從而說(shuō)明中、高劑量的OPP能夠促進(jìn)垂體LH和FSH的分泌和睪丸AR的合成,這可能是OOP補(bǔ)充有效預(yù)防CTX引起血清睪酮降低、改善性功能和生殖功能的生物學(xué)機(jī)制。

表5 各組大鼠血清FSH、LH和睪丸AR含量的變化

3 討論

目前研究PADAM的動(dòng)物模型很少,主要采用自然老化的更年期大鼠模型。由于20～24月齡的大鼠較為接近于PADAM的生物學(xué)特性[22],但是自然老化的更年期大鼠飼養(yǎng)成本較高,來(lái)源非常稀少。由于CTX具有生殖毒性,可導(dǎo)致睪丸損傷、生精功能障礙、染色體畸變、睪酮合成障礙等[22,27]。何清湖等[22]給大鼠連續(xù)5 d腹腔注射CTX 20 mg/kg,30 d后發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組大鼠毛發(fā)發(fā)黃、卷曲、干枯無(wú)光澤,體重減輕,活動(dòng)減少,血清TT、FT含量極顯著性降低,睪丸系數(shù)顯著下降,曲精小管直徑縮小、間距增寬、生精上皮變薄、生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少等,這些退行性變化與PADAM基本相似,從而說(shuō)明應(yīng)用CTX復(fù)制PADAM 動(dòng)物模型是可行的。由于PADAM的發(fā)生是由于體內(nèi)睪酮水平部分降低或靶器官對(duì)睪酮或其活性代謝產(chǎn)物的敏感性降低而產(chǎn)生的一種臨床狀態(tài)[5],因此睪酮水平是判定PADAM的重要指標(biāo)之一。本研究通過(guò)連續(xù)5 d給雄性大鼠腹腔注射20 mg/kg體重的CTX,6周后 PC組血清TT、FT水平均有顯著性低于NC組(P<0.05),這與何清湖等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[22],從而說(shuō)明本研究通過(guò)注射小劑量的CTX成功復(fù)制了PADAM 大鼠模型。

交配實(shí)驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^(guò)受試動(dòng)物捕捉、騎跨等性行為的潛伏期和次數(shù)可直接反映出大鼠性功能的強(qiáng)弱,當(dāng)其中一項(xiàng)結(jié)果有差異性時(shí),即可表明性行為實(shí)驗(yàn)成功[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組相比,PC組不僅捕捉潛伏期和交配潛伏期顯著性增長(zhǎng)(P<0.05),交配次數(shù)顯著性降低(P<0.05),而且精子數(shù)量和活力顯著性降低(P<0.05),精子活率極顯著性降低(P<0.01)。由于精子數(shù)量和精子活力則是判定精子質(zhì)量的重要指標(biāo),有充足數(shù)量和活力的精子才能運(yùn)動(dòng)到輸卵管完成受精活動(dòng)。從而說(shuō)明,在大鼠PADAM的形成過(guò)程中,伴隨著血清睪酮的降低,其性功能和生殖功能會(huì)顯著減弱。

睪酮的合成與分泌和精子的產(chǎn)生受到下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamus-pituitary-gonads axis,HPG)的調(diào)控。垂體分泌的LH又稱(chēng)間質(zhì)細(xì)胞刺激素(ICSH),與間質(zhì)細(xì)胞膜上的LH受體結(jié)合,促進(jìn)睪酮在線粒體內(nèi)合成;而生精過(guò)程受睪酮及FSH的雙重控制,FSH作用于曲細(xì)精管起始動(dòng)生精作用,而LH通過(guò)睪酮有維持生精的效用[29-30]。雖然有研究發(fā)現(xiàn),CTX在導(dǎo)致血清TT含量下降的同時(shí),血液中FSH和LH含量不僅沒(méi)有降低,反而有所增加,并認(rèn)為這可能與負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn),與NC組相比,PC組血清LH含量極顯著性降低(P<0.01),而FSH含量有所降低,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從而說(shuō)明CTX引起大鼠PADAM形成的同時(shí),血清睪酮含量的下降,在一定程度上與垂體分泌LH的減少有關(guān),其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。雖然生精細(xì)胞無(wú)AR,但是支持細(xì)胞中含有豐富的AR,睪酮與支持細(xì)胞上AR結(jié)合,促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成為生精細(xì)胞精子的生成提供了營(yíng)養(yǎng)支持[30]。本研究發(fā)現(xiàn),與NC組相比,PC組睪丸中AR含量顯著性降低(P<0.05)。因此,在CTX誘導(dǎo)PADAM形成過(guò)程中,垂體LH分泌的減少導(dǎo)致睪丸睪酮合成和分泌減少的同時(shí)伴隨著睪丸AR表達(dá)的降低,從而引起精子數(shù)量的減少以及精子活率和精子活力的降低。

OOP是利用現(xiàn)代酶解技術(shù)水解牡蠣蛋白形成的小分子寡肽,可以不經(jīng)消化迅速被吸收,其吸收率、生物效價(jià)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比游離氨基酸更高。為了進(jìn)一步探討OOP的補(bǔ)充對(duì)PADAM形成的干預(yù)作用,本研究在PADAM形成的同時(shí)補(bǔ)充不同劑量的OOP,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與PC組相比,PLO組血清TT、FT、FSH、LH含量均無(wú)顯著性升高(P>0.05),PMO和PHO組血清TT、FT、FSH、LH和睪丸AR含量顯著增加,且PMO和PHO組血清TT、FSH含量顯著高于PLO組,PHO組血清LH和睪丸AR含量顯著高于PLO組(P<0.05)。其與陳悅的研究結(jié)果[20]相同,從而進(jìn)一步說(shuō)明在CTX誘導(dǎo)PADAM形成的過(guò)程中補(bǔ)充OOP,不僅能夠促進(jìn)LH和FSH的分泌,有效防止CTX引起的血清TT和FT含量的降低,而且能夠促進(jìn)睪丸AR的表達(dá),有效防止PADAM的形成。

本研究還發(fā)現(xiàn),PLO組捕捉潛伏期顯著縮短,捕捉次數(shù)和交配次數(shù)顯著增多(P<0.01),PMO和PHO組捕捉潛伏期和交配潛伏期顯著縮短、捕捉次數(shù)和交配次數(shù)顯著增多(P<0.05),且PMO和PHO組的交配次數(shù)顯著多于PLO組(P<0.01)。當(dāng)受試動(dòng)物捕捉、交配的潛伏期和次數(shù)等性行為中一項(xiàng)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí),即可表明干預(yù)物質(zhì)對(duì)性功能具有一定的促進(jìn)作用[21],從而說(shuō)明,在PADAM形成的同時(shí)補(bǔ)充不同劑量的OPP均能有效地改善機(jī)體的性功能,但以中、高劑量為好。與此同時(shí),與PC組相比,PMO組精子數(shù)量雖然不能顯著性增多(P>0.05),但精子活率和精子活力顯著性增大(P<0.01,P<0.05),而PHO組精子數(shù)量、精子活率和精子活力均極顯著性增加(P<0.01),且PHO組的精子活率顯著高于PLO組(P<0.05)。從而說(shuō)明隨著OOP補(bǔ)充劑量的增加,精子數(shù)量、精子活率和精子活力的增加幅度也增大,這與李大煒的研究結(jié)果[21]相似。因此,在CTX誘導(dǎo)PADAM形成的過(guò)程中,OOP的補(bǔ)充不僅能夠促進(jìn)LH和FSH的分泌,能夠促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的生成和支持細(xì)胞AR的表達(dá),有效防止CTX引起的血清TT和FT含量的降低和PADAM的形成,而且對(duì)改善性功能和生殖功能具有非常重要的作用,并具有一定的劑量效應(yīng),以中、高劑量的OOP效果較好。

4 結(jié)論

在CTX誘導(dǎo)PADAM形成的同時(shí),補(bǔ)充不同劑量的牡蠣低聚肽能夠改善HPG軸的功能,有效防止CTX引起的睪酮降低和PADAM的形成,并改善性功能和生殖功能,以中、高劑量的牡蠣低聚肽效果較好。