發(fā)芽處理對青稞β葡聚糖抗氧化和抗炎作用的影響

孫昌武,謝云飛,姚衛(wèi)蓉,郭亞輝,成玉梁,錢 和

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

青稞(Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook. F.)是一種高海拔禾谷類農(nóng)作物,主要生長在青藏高原地區(qū)[1-2],近年來由于其β-葡聚糖含量遠高于其他谷物而引起人們的關注。β-葡聚糖是一種水溶性膳食纖維,由β-D吡喃葡萄糖單元組成的線性均多糖[3],由約70%的(1→4)鍵和30%的(1→3)鍵組成,由于來源和提取分離方法的不同而導致其分子量不同,一般在20～3100 kDa之間[4-5]。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種多因素疾病[6],該病的發(fā)病率在全球均呈持續(xù)增加趨勢。炎癥期間,腸道免疫反應過度亢進引起腸粘膜損傷,同時腸道內(nèi)部的氧化還原失衡,過氧化物的過量產(chǎn)生會導致腸道進一步的損傷[7]。據(jù)文獻報道,適量攝入β-葡聚糖對人體腸道有益,它可通過抗氧化特性和抗炎特性來緩解腸道在炎癥期間受到的損傷[8-11]。

研究發(fā)現(xiàn),分子量的降低或結(jié)構的改變會增強β-葡聚糖的抗氧化能力,改善其抗炎作用[12-14]。已經(jīng)有采取物理或化學方法如輻射、熱處理、酸解來降解多糖[15-17],但很少有關于發(fā)芽改變β-葡聚糖分子量從而改變其功能活性的文獻。有報道稱發(fā)芽過程中β-葡聚糖內(nèi)切酶的活性增加[18],這可能會引起β-葡聚糖的分子量和結(jié)構的變化。

本文對青稞進行發(fā)芽處理,采用水溶醇沉法并經(jīng)過耐高溫α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、木聚糖酶和胰蛋白酶除雜提取青稞β-葡聚糖,比較其體外抗氧化能力,并用脂多糖(LPS)誘導腸上皮細胞(Caco-2細胞)的炎癥模型來研究β-葡聚糖的抗炎作用,以期為發(fā)芽改善青稞β-葡聚糖對炎癥期間腸道的保護能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隆子黑青稞 西藏藏緣青稞有限公司提供;人結(jié)腸癌細胞Caco-2、完全培養(yǎng)液(內(nèi)含MEM培養(yǎng)基、20%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和1%丙酮酸鈉) 中國科學院上海細胞庫;細胞存活率檢測試劑盒(CCK-8試劑盒) 上海碧云天生物技術有限公司;腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、FRAP鐵離子還原能力測定(FRAP)試劑盒 南京建成生物有限公司;β-葡聚糖檢測試劑盒(混聯(lián)) Megazyme公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;多糖標準品Dextran T-2000(Mw2000000)、Dextran T-300(Mw300600)、Dextran T-150(Mw135030)、Dextran T-10(Mw9750)、Dextran T-5(Mw2700)、葡萄糖(Mw180) 中國食品藥品檢定研究院;無水乙醇等其他化學試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

Waters 1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司;PL2002電子天平 Mettler Toledo儀器有限公司;M5酶標儀 美國Molecular Devices公司;電熱恒溫水浴鍋 常州市朗越儀器制造有限公司;冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)芽青稞的制備 挑選無蟲蛀及霉斑、顆粒飽滿的青稞種子,在室溫下用0.05%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min,對種子表面進行滅菌,然后用去離子水漂洗數(shù)次,瀝干。發(fā)芽前,在黑暗的培養(yǎng)箱中將青稞種子在去離子水中浸泡24 h。用去離子水沖洗后,將其平鋪在自動恒溫(25 ℃)發(fā)芽機上,分別于0、6、12、18、24、30 h取樣。收集青稞種子在-20 ℃預冷后進行冷凍干燥,之后打粉通過60目篩后在-20 ℃下儲存,然后進行下一步的化學分析。

1.2.2 青稞β-葡聚糖的含量檢測和提取 根據(jù)Gunjan等[19]的方法進行修改。將50 g青稞粉與500 mL 80%(v/v)乙醇在90 ℃下回流2 h。然后在50 ℃下用1000 mL純水將水溶性β-葡聚糖提取兩次,持續(xù)2 h。離心后(4000×g,15 min),將提取物合并,并在60 ℃真空下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原始體積的1/3。然后,依次使用熱穩(wěn)定的α-淀粉酶(20 U/mL),β-1,4-木聚糖內(nèi)切酶(1 U/mL)和胰酶(5 U/mL)去除淀粉、木聚糖和蛋白質(zhì)。隨后,將提取物加入三倍體積的95%(v/v)乙醇在4 ℃下過夜。將沉淀物用70%的乙醇洗滌兩次,然后在80 ℃的純水中重新溶解。離心(4000×g,15 min)后,將上清液轉(zhuǎn)移至3 kDa的超濾管中,通過離心(3500×g,25 min)六次徹底除去分子量小于3 kDa的化合物。最后,將可溶性β-葡聚糖冷凍干燥,得分別發(fā)芽0、6、12、18、24、30 h的青稞β-葡聚糖記作QBG0、QBG6、QBG12、QBG18、QBG24、QBG30。使用β-葡聚糖檢測試劑盒(混聯(lián))檢測發(fā)芽過程中β-葡聚糖含量和提取后的純度。

1.2.3 青稞β-葡聚糖的分子量測定 QBG的重均分子量(Mw)和多分散度(Mw/Mn)是通過高效凝膠過濾色譜法檢測。將樣品配成5 mg/mL的水溶液,用0.22 μm水系微孔過濾后進樣20 μL,采用色譜柱UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm),檢測器為Waters 2414示差折光檢測器,以0.1 mol/L NaNO3為流動相,流速為0.9 mL/min,柱溫45 ℃。

將Dextran T-2000、Dextran T-300、Dextran T-150、Dextran T-10、Dextran T-5、葡萄糖相繼進樣,記錄各自的保留時間TR。得到多糖分子量與保留時間回歸方程:logMw=-0.459TR+12.3(R2=0.9952),其中Mw為重均分子量,TR為保留時間。待測樣品以相同條件進樣,根據(jù)回歸方程計算得到其重均分子量。

1.2.4 青稞β-葡聚糖的抗氧化能力 將1.2.2得到的青稞β-葡聚糖于去離子水中溶解成濃度為10 mg/mL的多糖溶液作后續(xù)抗氧化能力測定。

1.2.4.1 鐵離子還原能力的測定(FRAP) FRAP值根據(jù)Benzie等[20]的方法測定。將乙酸鹽緩沖液(300 mmol/L,pH=3.6)、10 mmol/L的TPTZ鹽酸溶液(40 mmol/L)和20 mmol/L FeCl3溶液按照10∶1∶1的比例混合配制FRAP試劑,在37 ℃水浴鍋中溫浴,現(xiàn)用現(xiàn)配。將0.1 mL多糖溶液(10 mg/mL)與3 mL FRAP試劑混合,室溫下反應6 min后立即在593 nm處檢測吸光度。用不同濃度的FeSO4·7H2O溶液繪制標準曲線,得到標準曲線公式為Y=7.2048X-0.0103(R2=0.9991)。其中X為吸光度;Y為FRAP值,單位mmol/L Fe2+。

1.2.4.2 DPPH自由基抑制率的測定 根據(jù)Kozarski等[21]的方法進行修改來測定。將1 mLβ-葡聚糖溶液(10 mg/mL)與1 mL新鮮制備的0.2 mmol/L DPPH溶液(用純DMSO配置)以及2 mL DMSO混合,避光放置30 min,以純DMSO調(diào)零測定其在517 nm的吸光度,此為樣品組Ai。將每個樣品與3 mL DMSO溶液混合,避光放置30 min,以純DMSO調(diào)零測定其在517 nm的吸光度,此為對照組Aj。再測定1 mL DPPH溶液與3 mL純DSMO混合溶液在517 nm的吸光值,此為空白組的Ac。DPPH自由基抑制率由方程得出:

1.2.4.3 ABTS(2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基抑制率測定 根據(jù)Arnao等[22]的方法進行修改來測定。將7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2SO4溶液等量混合,室溫下黑暗中反應12 h制備ABTS工作液。然后通過將1 mL ABTS溶液與60 mL甲醇混合來稀釋工作液,使工作液在734 nm吸光度為1.1±0.02。將150 μL多糖溶液(10 mg/mL)與2850 μL稀釋后的ABTS工作液在黑暗中反應2 h,以甲醇作為空白在734 nm處檢測吸光度。

式中:As為樣品吸光度,Ac為蒸餾水代替樣品吸光度。

1.2.5 發(fā)芽青稞β-葡聚糖對LPS誘導Caco-2細胞炎癥模型的影響

1.2.5.1 細胞培養(yǎng) 將Caco-2細胞加入完全培養(yǎng)基復蘇后傳至第三代,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d更換一次培養(yǎng)液,待細胞貼壁生長至80%時用胰酶-EDTA按比例消化傳代。

1.2.5.2 不同發(fā)芽時期的β-葡聚糖對Caco-2細胞存活率的影響 取對生長期細胞,以2×105個/mL的密度在96孔板中均勻加入200 μL,每組5個平行,等細胞達到70%貼壁時,吸掉培養(yǎng)基,先后加入含有β-葡聚糖和LPS的培養(yǎng)基,使β-葡聚糖終濃度達到200 μg/mL,LPS濃度為10 μg/mL,48 h后,每孔加入10 μL CCK-8,孵育2 h后在450 nm下讀板。

1.2.5.3 細胞因子和氧化應激參數(shù)檢測 將細胞用青稞β-葡聚糖和LPS處理并培養(yǎng)48 h后,小心收集細胞加入裂解液后離心取上清液凍存,使用試劑盒確定TNF-α、IL-6、NO、PGE2、SOD、GSH、MDA水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用graphpad prism 6.0軟件和SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽過程青稞β-葡聚糖含量和分子量變化

由表1可以看出,未發(fā)芽青稞β-葡聚糖的含量為3.77%,高于姚豪穎葉[23]得出來的平均值2.45%,青稞β-葡聚糖含量在發(fā)芽前24 h含量一直上升,最高含量為4.60%,這與王波等[24]的研究結(jié)果有一定差別,原因可能是檢測方法差異導致部分不可溶性β-葡聚糖未檢出,也有可能是由于品種、品質(zhì)差異。β-葡聚糖的分子量在發(fā)芽期間顯著降低(P<0.05),未發(fā)芽前β-葡聚糖的重均分子量為275.74 kDa,經(jīng)過30 h后,分子量降低到114.63 kDa。該結(jié)果與Ahmad等[25]研究大麥發(fā)芽結(jié)果一致,這可能是因為在發(fā)芽過程中,存在于谷物種子胚乳中的β-葡聚糖酶活性明顯增加,對β-葡聚糖產(chǎn)生了降解作用[26]。

表1 發(fā)芽過程青稞β-葡聚糖含量和分子量變化

2.2 發(fā)芽過程青稞β-葡聚糖的抗氧化能力變化

圖1顯示了不同發(fā)芽時間青稞β-葡聚糖(10 mg/mL)的抗氧化能力變化。FRAP值反映了樣品的還原能力[27]。如圖1(A)所示,未發(fā)芽青稞中β-葡聚糖的FRAP值為2.47 mmol/L Fe2+,經(jīng)過發(fā)芽處理后,其還原能力持續(xù)上升,在30 h達到最高值3.35 mmol/L Fe2+,上升了35.63%,說明發(fā)芽使青稞β-葡聚糖的總還原能力得到顯著增強(P<0.05)。

圖1 發(fā)芽過程青稞β-葡聚糖的抗氧化能力變化

DPPH·和ABTS+·是用于確定β-葡聚糖抗氧化活性的自由基,適用于親水性和親脂性物質(zhì)的抗氧化能力測定。如圖1(B)可以看出,未發(fā)芽的青稞β-葡聚糖的DPPH自由基抑制率為5.53%,隨著發(fā)芽時間的延長,在30 h時其值達到最大值19.28%,ABTS自由基抑制率變化趨勢與之相似,發(fā)芽30 h從9.11%提升到16.45%。

盡管這三種分析方法測定抗氧化能力的機理并不完全相同,但上述實驗結(jié)果一致表明發(fā)芽可以顯著(P<0.05)提高青稞β-葡聚糖的抗氧化能力。多糖的分子量與其抗氧化能力具有直接關系,如潘瑩等[28]、徐雪峰[29]等均發(fā)現(xiàn)分子量不同的植物多糖組分對自由基的清除能力不同。發(fā)芽過程中β-葡聚糖酶的作用增強,導致青稞中β-葡聚糖含量發(fā)生變化,而在同等濃度下,發(fā)芽時間越長,獲得的青稞β-葡聚糖分子量越低,可能使羥基暴露或者產(chǎn)生了更多可以充當自由基猝滅劑的異頭氫,使其抗氧化能力得到增強[30]。從24到30 hβ-葡聚糖含量下降不顯著(P>0.05),但其抗氧化能力上升顯著(P<0.05),說明經(jīng)過發(fā)芽處理后的青稞β-葡聚糖更加具有作為抗氧化劑的潛力。

2.3 發(fā)芽青稞β-葡聚糖對LPS誘導Caco-2細胞炎癥模型的影響

2.3.1 細胞存活率 如圖2模型組(LPS組)所示,Caco-2細胞經(jīng)過LPS(10 μg/mL)處理后,細胞的存活率較空白組(CON組)相比下降了51.25%。當加入不同發(fā)芽時間的β-葡聚糖(200 μg/mL)時,Caco-2細胞的存活率較LPS組有所上升,且發(fā)芽時間越長,得到的β-葡聚糖對抑制LPS誘導的Caco-2細胞炎癥模型效果越明顯,發(fā)芽時間30 h提取的β-葡聚糖對細胞的保護作用最強,存活率最高達到69.27%。

圖2 發(fā)芽青稞β-葡聚糖對Caco-2細胞炎癥期間存活率的影響

2.3.2 細胞因子 通過測定炎癥因子來評估β-葡聚糖對LPS誘導的Caco-2細胞炎癥狀態(tài)的影響。TNF-α是參與IBD病程中組織損傷的關鍵促炎免疫介質(zhì),其含量的下降與IBD的改善密切相關[31-32]。IL-6是炎癥反應中重要的細胞因子,在機體發(fā)生炎癥時,細胞分泌IL-6可以促進炎癥反應。如圖3(A)所示,TNF-α在空白組細胞中的含量為139.75 ng/L,當受到10 μg/mL LPS刺激時,TNF-α的含量顯著提升到462.19 ng/L(P<0.05),當加入200 μg/mL發(fā)芽青稞β-葡聚糖干預時,其含量得到顯著抑制(P<0.05),青稞發(fā)芽時間越長獲得的β-葡聚糖對炎癥期間Caco-2細胞分泌的TNF-α抑制越強,抑制能力最強為發(fā)芽30 h的青稞β-葡聚糖,TNF-α含量降低到了274.87 ng/L,與未發(fā)芽青稞獲得的β-葡聚糖相比降低了40.53%。圖3(B)中IL-6的含量也是在模型組中顯著上升(P<0.05),樣品組中發(fā)芽青稞β-葡聚糖能夠顯著減少Caco-2細胞分泌的IL-6(P<0.05),最高降低到58.15%。這說明發(fā)芽青稞β-葡聚糖能夠顯著降低Caco-2細胞在LPS誘導的炎癥模型中分泌的TNF-α和IL-6含量,對于調(diào)節(jié)炎癥具有至關重要的作用。

圖3 青稞β-葡聚糖對Caco-2細胞炎癥期間細胞因子分泌的影響

促炎因子介導機體體液免疫和細胞免疫,促進炎癥反應以達到快速清除抗原的目的。然而,過度表達的促炎癥因子會導致炎癥反應失控,持續(xù)的免疫應答將會導致機體的自我破壞,如PGE2、NO的顯著升高可以誘發(fā)氧化損傷造成正常細胞和組織的炎癥反應[33]。因此,在炎癥后期抑制促炎癥因子的表達同時促進抗炎因子的表達有助于恢復機體免疫功能平衡。如圖3所示,與正常對照組相比,LPS刺激能顯著誘導Caco-2細胞促炎因子PGE2和NO的釋放(P<0.05),而與模型組相比,200 μg/mL的β-葡聚糖能使損傷細胞中的PGE2、NO分泌水平分別下降48.84%、32.47%,反映β-葡聚糖可抑制LPS誘導的腸上皮細胞炎癥反應,且發(fā)芽時間越長得到的青稞β-葡聚糖效果越明顯。由于發(fā)芽會降低青稞β-葡聚糖的分子量,因此可以推斷出分子量越小,其抗炎作用越強,與Lin等[34]的研究一致,其原因可能是分子量越小,β-葡聚糖的低粘度和高流動性使其能夠更好地與Caco-2細胞表面受體接觸并發(fā)揮其抗炎作用。

2.3.3 氧化應激參數(shù) 在腸炎期間,由于機體內(nèi)的過度免疫反應會產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),導致氧化還原水平失衡,從而使腸道受到一定的氧化損傷。具有抗氧化活性的物質(zhì)能夠中和或轉(zhuǎn)移ROS,例如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等可以減輕IBD期間的腸道損傷,改善腸上皮細胞的屏障功能[35]。如圖4(B)、4(C)所示該實驗中通過β-葡聚糖的干預可以顯著(P<0.05)增加炎癥期間SOD的活性和GSH的分泌水平來維持細胞內(nèi)的氧化還原的動態(tài)平衡,減少自由基對自身的損害作用。丙二醛(MDA)則是分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應而形成的一種代表性脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物[36],能夠間接反映出細胞或組織受到氧自由基攻擊后受損程度。如圖4(A)所示,經(jīng)過發(fā)芽后的β-葡聚糖能夠顯著(P<0.05)降低MDA在炎癥期間的產(chǎn)生,從而改善細胞在炎癥期間受到的氧化損傷。綜上所述,小分子量的β-葡聚糖可以顯著改善腸道炎癥期間氧化應激水平,從而緩解腸道細胞受到二次損傷。

圖4 青稞β-葡聚糖對Caco-2細胞炎癥期間氧化應激參數(shù)的影響

3 結(jié)論

本文主要研究了發(fā)芽過程中青稞β-葡聚糖通過抗氧化能力和抗炎作用對炎癥期間腸道的保護作用。研究結(jié)果顯示,青稞β-葡聚糖的含量在發(fā)芽過程中總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,分子量在發(fā)芽過程中呈現(xiàn)下降趨勢;同時,發(fā)芽30 h提取的β-葡聚糖呈現(xiàn)出更好的抗氧化性且能夠有效地抑制LPS造成的Caco-2細胞炎癥損傷,提高細胞存活率,顯著抑制炎癥模型中細胞因子TNF-α、IL-6、PGE2、NO的分泌,并且有效改善細胞炎癥期間的氧化應激水平。綜上所述,發(fā)芽會降低青稞β-葡聚糖分子量并增強其抗氧化能力和抗炎作用,從而緩解腸道在炎癥期間所受到的損傷,因此在食品工業(yè)中具有更好的發(fā)展?jié)摿Α６l(fā)芽導致青稞β-葡聚糖的分子量下降,其結(jié)構是否發(fā)生變化,如何建立青稞β-葡聚糖的分子量、結(jié)構與生物活性之間的構效關系也是今后研究的方向。