基于腸道菌群探討泡菜中乳酸菌防治非酒精性脂肪肝的研究

王報貴,許海波,杜 文,王 君,孫春龍,董 彬,吳 濤,方菁菁

(1.濱州學院生物與環境工程學院,山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室,山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心,濱州市食品安全重點實驗室,山東濱州 256603;2.濱州學院體育學院,山東濱州 256603)

泡菜是一種以新鮮蔬菜為原料經微生物發酵而得到的食品,因口感清脆、富含礦物質、纖維素,成為人民日常生活中不可缺少的食物[1-2]。以乳酸菌為代表的一大類益生菌在泡菜的制作中發揮著重要的角色,它們通過生成的發酵產物來降低腸道內環境的pH,有害菌由于在較低酸度下無法生存而被抑制或被殺死,使腸道有益菌數目良性增長,從而調節了腸道菌群的穩定性和多樣性[1,3-4]。泡菜中的乳酸菌在調節腸道菌群平衡中起著重要作用,而且具有一定治療效果,可以減輕和逆轉肝臟細胞損傷,極具臨床價值。在未來,以乳酸菌為代表的益生菌極有可能是控制腸道微生物群穩定的安全和有效的治療工具[5-7]。

非酒精性脂肪肝病是除大量飲酒之外的其他肝損傷因素導致的臨床上的病理綜合征,其特點是肝細胞損傷[8],脂肪沉積[9],腸道菌群紊亂失調[10]。研究報道非酒精性脂肪肝病(NAFLD)會造成體內肝脂水平升高和腸道菌群紊亂[9,11]。雖然沒有充分解釋NAFLD的發生機制,但腸道內菌群的不平衡[12]與該疾病的發生密切相關[10]。近年來研究人員們普遍接受的說法是包括遺傳性因素、飲食因素以及代謝因素、肥胖因素等作用綜合而成的“多重打擊學說”[5,11]。所以通過改變生活方式可以在一定程度上控制NAFLD的發生和進展,尤其是可以利用調節飲食因素。Han等[12]的研究表明發酵的泡菜可以使一些有益菌相對豐度增加,有害菌相對豐度減少,這就表明了發酵泡菜對腸道菌群的確具有有益的調節作用。陳文瀚等[13]的研究得出結論:腸道菌群這一指標在健康人與NAFLD患者之間存在顯著差異,這種差異可以通過乳酸菌補充劑來減少,使癥狀有所緩解。以上報道發現腸道細菌與非酒精性脂肪肝之間有密切聯系。因此,把腸道菌群作為靶點來研制藥物便成為現代醫學治療和緩解NAFLD的主要致力方向[14]。研究表明益生菌可通過調節動物腸道內菌群的平衡,起到減輕肝脂變動物肝臟損傷和降低血脂[15],最終有助于NAFLD的控制和治療,但并未有具體的菌株報道[16-18],本文意在篩選出對NAFLD疾病防治有益的確切菌株。

鑒于此,本論文擬通過采用蛋氨酸-膽堿缺乏飼料(Methionine-choline deficient diet,MCD)喂食C57BL/6J小鼠,成功構建NAFLD疾病小鼠模型,進一步檢測從泡菜中分離得到的益生菌對患病小鼠腸道平衡性、脂質沉積、肝功能和炎癥因子水平的影響,從而初步確定在泡菜中提取的益生菌對于NAFLD小鼠的腸道菌群和肝臟的作用。本研究將對證實腸道菌群可作為尋找和防治NAFLD藥物的新靶點產生實質性意義,同時為未來開發和研制NAFLD的靶向治療藥物提供攻關方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無特定病原體(Specified pathogens free,SPF)級C57BL/6J雄性小鼠,7-8周齡 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號:SCXK(魯)20140007];MCD、MCS飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司(飼料代碼為TP3005G);維持飼料 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號:SCXK(魯)20180003];MRS固體培養基 生工生物工程股份有限公司;MRS肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限公司;Slanetz-Bartley培養基、麥康凱瓊脂培養基 北京索萊寶科技有限公司;GAM厭氧培養基 上海西寶生物科技有限公司;市售泡菜 吉林市咕咕熊食品有限責任公司;白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、谷草轉氨酶(ALT)、谷丙轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所;TG和TC試劑盒 日本協和醫藥診斷株式會社。

DHP-9052型電熱恒溫培養箱 中儀國科科技有限公司;BKQ-B50II型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科生物產業有限公司;ZD-85型數顯氣浴恒溫振蕩器 成都市宜邦科析儀器有限公司;TDZ4-WS型臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;GFL-70型電熱鼓風干燥箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司;DNM-9602型酶標分析儀 北京普朗新技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NAFLD模型的建立 采用MCD喂食C57BL/6J雄性小鼠,構建NAFLD疾病小鼠模型。SPF級C57BL/6J雄性小鼠30只,7～8周齡,每只(20±2) g,飼養于本部屏障環境內,溫度22～25 ℃,濕度50%,12 h晝夜交替適應性喂養1周后,根據隨機數字表法分為2組:對照組(10只)和模型組(20只),模型組喂食MCD飼料,對照組喂食MCS飼料。實驗周期為6周,期間動物自由飲水、攝食。采用肝臟蘇木精-伊紅染色(HE)、TG和TC含量測定和免疫因子測定等多種生物學方法確定脂變模型的建立[19]。

1.2.2 泡菜中益生菌的分離與鑒定 采用平板涂布法進行分離。

1.2.2.1 分離方法 用天平精確稱取50 g泡菜樣品,加入和樣品等比例的無菌PBS緩沖液,在室溫下充分粉碎混勻,使其自然沉淀。吸取1 mL上清液放入含有9 mL PBS緩沖液的試管中,梯度稀釋至10-2～10-6濃度后,均勻涂布于MRS固體培養基上。于37 ℃恒溫厭氧培養箱內倒置培養48 h后觀察菌株生長情況。

1.2.2.2 菌種的鑒定 通過分離純化,得到一株優勢菌株,利用16S rDNA分子生物學特征鑒定。根據V3區兩端保守區設計引物,則能夠擴增細菌V3區相對應的可變區片段,測序分析比較來初步確定菌種的位置。設計引物為 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′,R:5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以待測菌基因組為模板進行PCR擴增,反應體系:pfu mix 5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0. 5 μL,ddH2O 3 μL,DNA模板1 μL。PCR擴增反應程序為:95 ℃ 10 min;然后于95 ℃ 10 min,55 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,擴增30個循環;72 ℃ 10 min。PCR擴增后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到目的條帶后,PCR產物經膠回收后克隆到T載體上由英濰捷基貿易有限公司進行序列的測定。

1.2.2.3 系統樹建立方法 測序獲得的16S rRNA基因的序列,分別登錄EzBioCloud數據庫(http://www.ezbiocloud.net/)與NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),分別進行序列比對。系統發育分析采用MEGA 5.0軟件進行多序列匹配排列,使用MEGA 5.0軟件的Kimura2-parameter方法計算進化距離,使用Neighbor-joining方法,1000次隨機抽樣,構建系統發育樹,以自引導值(Bootstrap)表示系統發育樹的可信度,構建系統發育樹。

1.2.3 菌液濃度的確定 增菌方法:將分離得到的菌種接種到MRS液體培養基增菌,37 ℃厭氧培養,等到對數生長期時轉種到錐形瓶里擴大培養,瓶底可見白色菌體沉淀。取錐形瓶中的渾濁液適量于50 mL離心管中,用臺式離心機以10000 r/min離心5 min。取出后用PBS緩沖液洗滌。后續再次離心處理,使得到的上清液與沉淀重懸,最終得到菌液。將菌液以10倍梯度稀釋至10-2～10-6濃度,涂布于MRS固體培養基上培養,待菌落長出后計數并確定菌液濃度。

1.2.4 小鼠的灌胃試驗 NAFLD模型建立成功后,用于實驗的益生菌濃度為107cfu/mL。用該濃度菌液對小鼠進行灌胃調節,連續6周。肝脂變模型組小鼠分為自然恢復組和實驗組。對照組和自然恢復組灌胃無菌PBS緩沖液,實驗組給予益生菌菌液灌胃,灌胃劑量0.3 mL/10 g體重/每天,每日一次,固定時間。實驗過程中均無小鼠死亡。

1.2.5 活菌計數法選擇性培養小鼠腸道菌 各組小鼠的糞便每隔2周收集一次,整個實驗周期內共收集4次糞便,分別為灌胃前、灌胃2周、灌胃4周和灌胃6周。若不當天使用,采集的糞便應先加入適量30%甘油保存在冰箱中。具體操作步驟如下:稱取各組糞便0.1 g于潔凈的EP管中,與0.9 mL PBS混勻后將該混合液制備成10-2～10-8不同濃度梯度的稀釋液,各取200 μL涂布于不同的選擇培養基進行相應菌的培養:a. 添加莫匹羅星的MRS瓊脂培養基用于雙歧桿菌的篩選(在37 ℃下厭氧孵育36 h);b. 不含L-半胱氨酸的MRS瓊脂用于乳酸桿菌的篩選(厭氧,37 ℃,24 h);c. Slanetz-Bartley培養基用于腸球菌的篩選(需氧,37 ℃,24 h);d. 麥康凱瓊脂培養基用于腸桿菌的篩選(需氧,37 ℃,24 h);e. 改良的岐阜厭氧(GAM)瓊脂培養基用于脆弱擬桿菌的篩選(需氧,37 ℃,24 h),待平板上長出菌落后,用平板菌落計數法計算每克糞便中對應的菌落數[20]。

1.2.6 肝臟外觀和組織學觀察 在整個灌胃周期結束后,采用眼球取血法將小鼠處死,并立即對其進行解剖。待完整分離小鼠肝臟和腹部脂肪后,將其放置于清潔平面上進行對比觀察,拍照記錄。腹部脂肪重量=腎周脂肪重量(g)+附睪脂肪重量(g),脂肪指數(%)=腹部脂肪重量/實驗末老鼠體重,觀察后將肝臟組織保存,用于后續進行HE染色[21]。

1.2.7 血清肝功能、血脂和炎癥因子的檢測 摘眼球取血法采集的血液放在血樣室,室溫靜置30 min后,3500 r/min離心10 min,分離血清。得到的血清分別用于肝功(ALP、AST和ALT)、血脂(TG和TC)和炎癥因子(IL-6和TNF-α)的檢測,具體檢測方法參考ELISA試劑盒說明書。

1.3 數據處理

本研究獲得的數據均采用SPSS 19.0軟件進行統計處理,兩組之間采用t檢驗。P<0.05為顯著性差異,P<0.01為極顯著差異,具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 NAFLD模型的建立

通過觀察外觀發現,MCS喂養的對照組肝表面顏色為暗紅色、色澤鮮亮,邊緣比較清晰,沒有脂肪感(圖1A);MCD喂養的模型組肝臟的顏色偏黃,體積明顯變大,切面具有脂肪感(圖1B)。HE染色發現,對照組肝組織結構完整清晰、肝小葉無異常,肝細胞呈現索狀排布,以放射狀環繞在中央靜脈周圍;細胞核大而圓,細胞質在胞內分布均勻,不見脂肪滴(圖1C);MCD模型組中肝臟細胞變化明顯,細胞質疏松;肝細胞排序混亂;細胞腫大,不見索狀排列,變圓;能看到較多的脂肪滴(圖1D)。這說明NAFLD模型建立成功,可用于后續實驗。

圖1 肝臟的外觀和HE染色

2.2 菌株鑒定

分別在EzTaxon server和NCBI中對菌株的16S rDNA基因進行比對分析,結果發現,與待測菌株相似度最高的菌株均為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),相似度為99.02%。分別選取相似度高的模式菌株的16S rRNA基因,以AcetobacteracetiNBRC 14818T為外圍參考菌株,構建系統發育樹,如圖2所示,待測菌株01與LactobacillusplantarumL71T聚到一簇,因此將待測菌株鑒定為植物乳桿菌。

圖2 基于16S rRNA基因的系統發育樹

2.3 灌胃植物乳桿菌對NAFLD對小鼠腸道菌群穩態的影響

圖3A表明,肝脂變小鼠灌胃植物乳桿菌后,從灌胃4周開始可顯著提高雙歧桿菌的數量,隨著灌胃時間的增加,雙歧桿菌的數量進一步增多并顯著高于自然恢復組(P<0.05),并且灌胃第4周后實驗組雙歧桿菌的數量超過對照組,說明灌胃植物乳桿菌可以促進腸道益生菌雙歧桿菌的增殖,使其恢復到健康小鼠水平。灌胃實驗對乳酸桿菌的數量的影響與對雙歧桿菌的影響類似(圖3B)。而通過對圖3的分析發現灌胃植物乳桿菌還可以降低腸球菌(圖3C)、腸桿菌(圖3D)和脆弱擬桿菌(圖3E)的數量。結果表明攝入從泡菜中提取的益生菌(植物乳桿菌)可以使腸道微生態紊亂狀態得到改善。

圖3 肝脂變小鼠灌胃植物乳桿菌對腸道菌群豐富度的影響

2.4 肝臟病理學檢測

觀察肝臟外觀發現,正常組肝表面顏色通常是暗紅色,通體發亮,邊緣清晰,沒有脂肪感(圖4A);自然恢復組肝臟的顏色發黃,肝臟較大,切面有脂肪感,邊緣圓潤,但較之灌胃前已有所改善(圖4C)。實驗組肝臟恢復狀態較好,呈現暗紅色,邊緣清晰,幾乎與正常肝臟無異(圖4B)。

圖4 肝脂變小鼠灌胃后肝臟外觀、HE染色和TG含量

由圖4可知,肝臟HE染色的對照組肝組織結構完整清晰、肝小葉無異常,肝細胞呈現索狀排布,以放射狀環繞在中央靜脈周圍;對照組細胞核大而圓,細胞質在胞內分布均勻,不見脂肪滴,TG含量僅為0.83 mg/g prot,TC含量為0.47 mg/g prot;實驗組、自然恢復組均有肝脂變情況,肝細胞變圓,排列無序,細胞質疏松且內含脂肪滴,自然恢復組脂肪滴較大;自然恢復組TG和TC含量分別為(2.99和1.38 mg/g prot)顯著高于實驗組(P<0.05)和對照組(P<0.01),實驗組也有脂肪滴存在,但相對脂肪含量較少(TG:1.36 mg/g prot,TC:0.63 mg/g prot)。實驗組細胞質分布均勻度比自然恢復組好,但仍次于對照組。這表明泡菜中的益生菌對肝臟病理狀態確有改善,但仍不能使肝臟內脂質的含量恢復到正常肝臟的水平,這很有可能是由于灌胃周期短造成的,可進一步延長實驗時間。

2.5 脂肪組織病理學檢測

機體內脂肪的大小和多少是衡量機體脂肪含量的重要標志。通過對小鼠腹部脂肪HE染色可見:實驗組的小鼠腹部脂肪(圖5B)體積明顯小于自然恢復組(圖5C),說明實驗組脂肪變形程度降低;但其脂肪體積略大于對照組(圖5A),說明灌胃益生菌可降低腹部脂肪體積,并使得實驗組老鼠的腹部脂肪含量接近正常健康小鼠體內脂肪水平(表1)。

圖5 肝脂變小鼠灌胃后腹部脂肪HE染色

表2 灌胃后小鼠血清肝功能指標檢測

表3 灌胃后小鼠血清TG、TC、IL-6,TNF-α含量的影響

表1 灌胃后小鼠腹部脂肪含量

2.6 血清肝功能指標檢測

灌胃6周后,實驗組血清中ALT和AST水平與對照組不具有顯著性差異(P>0.05);但與自然恢復組相比,血清中ALT和AST水平分別降低了0.42倍和0.23倍,具有顯著性差異(P<0.05),說明灌胃植物乳桿菌能使肝脂變小鼠血清中ALT和AST基本恢復到健康小鼠血清中水平。實驗組血清中ALP水平，與對照組相比明顯增加,具有顯著性差異(P<0.05),與自然恢復組相比其含量有著顯著性降低(P<0.05)。

2.7 對小鼠血清TG、TC、IL-6,TNF-α含量的影響

通過對血清中血脂和炎癥水平檢測發現,肝脂變小鼠灌胃益生菌后血清中TG和TC的含量與對照組相比分別降低了0.39倍和0.38倍(P<0.05),與自然恢復組相比增加了0.59倍和0.09倍;實驗組老鼠血清中IL-6和TNF-α的含量與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05),但與自然恢復組相比分別降低了0.39倍和0.33倍,具有顯著性差異(P<0.05)。說明MCD飲食造成血清中TG和TC水平降低,灌胃益生菌能促進血脂水平恢復到正常健康小鼠水平,并且能使血清中炎癥因子含量降低。

3 結論和討論

在NAFLD常規治療的基礎上,患者服用含有乳酸菌、雙歧桿菌或枯草芽孢桿菌的益生菌可顯著降低血液中ALT、AST水平,使肝損傷和肝纖維化程度減輕[22-23]。但是未有從膳食上改善NAFLD疾病的進展,如果通過日常膳食就可以避免NAFLD的發生將會大大降低該疾病的發生和發展。本文研究發現從泡菜中分離得到的植物乳桿菌可以顯著提高小鼠糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌的豐富度,降低腸球菌、腸桿菌和脆弱擬桿菌的數量;從而表明日常生活中食用泡菜對腸道菌群的紊亂有著積極作用,進一步能增強腸道屏障功能的作用。實驗中進一步發現攝食MCD飼料的肝脂變模型小鼠體重減輕明顯,并且實驗發現肝脂變模型老鼠肝臟中TG和TC含量顯著高于對照組,但是血清中TG和TC含量卻明顯低于對照組,通過灌胃植物乳桿菌6周后實驗組血清中脂質水平雖然與自然恢復組相比有一定程度的恢復,但是與對照組相比仍然未恢復到正常水平。分析原因主要是由于MCD飼料中缺乏蛋氨酸和膽堿從而導致了磷脂的合成受阻,而磷脂又是極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)的重要組成成分之一,磷脂的合成量減少使得肝臟中VLDL的合成和分泌量降低,導致了TG大劑量的積累在肝臟中而減少了運輸到血液中,從而導致了肝臟內TG水平升高、血清中TG水平的降低[24-25]。

本研究通過進一步對血清中肝功能(ALT、ALP和AST),肝脂和血脂水平的檢測發現分離得到的植物乳桿菌具有減少肝臟內脂質積累和增強肝功能的作用,該項研究與報道的副干酪乳桿菌[26]的作用相一致:副干酪乳桿菌能促進M2型Kupper細胞的極化,減少肝脂肪沉積和血清中的ALT水平,從而改善肝功能指標。鄭賢干等[27]的研究發現應用雙歧桿菌三聯活菌膠囊可以治療NAFLD,使得患者血清中IL-6和TNF-α炎癥因子的水平顯著降低,本文的研究印證了植物乳桿菌也具有降低炎癥因子的表達作用,從而保護肝臟并延緩NAFLD疾病的進展。結果表明泡菜作為傳統發酵食品,其在NAFLD的治療中發揮著重要作用,有著光明的開發和應用前景。