黃芪多糖對肺氣虛型變應性鼻炎大鼠TSLP、OX40L mRNA表達的影響

許江濤， 張麗娟， 霍宇航， 程娟娟， 陳鈺婷， 李得堂

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學附屬中山醫院，廣東中山 528400；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是特應性個體接觸致敏原后，由IgE 介導的介質釋放、多種細胞因子參與的鼻黏膜I 型變態反應[1]。臨床上以陣發性噴嚏、大量清水樣鼻涕、鼻癢和鼻塞為主要特征。變應性鼻炎屬于中醫學“鼻鼽”的范疇，肺氣虧虛，衛外不固，風寒客于鼻竅，肺失宣降，鼻竅不利是變應性鼻炎的病機關鍵，以肺氣虛型最為常見[2]。中醫臨床上多以補益肺氣法進行治療。中藥黃芪味甘、性微溫，入脾、肺經，有健脾補肺、益氣升陽、固表的作用，為補氣諸藥之最，在變應性鼻炎治療中有不可或缺的作用[3]。黃芪多糖作為黃芪的主要活性成分，能夠調節免疫平衡、增強免疫功能、抗菌及抑制病毒[4]，探討黃芪多糖對變應性鼻炎的治療作用對臨床藥物應用具有重要的意義。因此，本研究建立肺氣虛型變應性鼻炎復合大鼠模型，觀察黃芪多糖對其干預的作用及機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40 只SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，180～220 g，均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2016-0002]提供。實驗于廣州中醫藥大學實驗動物中心ABSL-2 實驗室（實驗室備案證號：粵廣動實備GZL0004號）完成。本實驗開展經廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物、試劑與儀器黃芪多糖（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：HA012740198）；氯雷他定片[拜耳醫藥（上海）有限公司，批號：JS07620]。卵清蛋白（OVA）（購自廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號：1706GYD005）；椰樹牌香煙（廣東中煙工業責任有限公司，批號：8112110148788116）；白細胞介素4（IL-4）、干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國BD 公司）；胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）、OX40 配體（OX40L）、β-actin 等引物（北京擎科新業生物技術有限公司合成）。酶標儀（美國Bio-Tek公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）；離心機（德國Eppendorf公司）。

1.3 分組與造模將40 只大鼠隨機分為正常組、模型組、氯雷他定組、黃芪多糖組，每組10 只。先建立肺氣虛證模型，再進行變應性鼻炎模型的構建。肺氣虛證大鼠模型建立：參照《實用中醫證候動物模型學》“煙熏法肺氣虛證動物模型”方法[5]，除正常組不作處理外，其余3 組大鼠放入特制玻璃煙熏造模箱，用椰樹牌香煙煙熏0.5 h，每天2次，連續28 d。肺氣虛型變應性鼻炎大鼠模型的構建：從肺氣虛證大鼠模型建立成功后第2 天開始，參考文獻[6]方法造模，分為基礎致敏和局部激發2 個步驟。基礎致敏： 將OVA 0.3 mg、A1（OH）330 mg 溶于1 mL 生理鹽水配制成致敏液，腹腔注射隔天1 次，共7 次；局部激發：取50 g/L OVA溶液（作為致敏液）100 μL，連續14 d滴鼻。

1.4 給藥在局部激發階段，即造模第14～27天，每次局部激發前30 min，氯雷他定組給予氯雷他定0.9 mg·kg-1·d-1[7]灌胃，黃芪多糖組給予黃芪多糖400 mg·kg-1·d-1[8]灌胃，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。共給藥14 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 肺氣虛證候[9]評價 在肺氣虛證造模結束當天，根據中醫診斷學“四診合參”，觀察大鼠相關證候并記錄。望：精神狀態、運動步態、毛色、呼吸情況、籠內異味、大便情況、進食量；聞：籠內異味；量：體溫。

1.5.2 變應性鼻炎癥狀評分[10]造模第27天末次鼻腔激發后30 min內，觀察大鼠鼻部過敏癥狀（鼻癢、噴嚏、流涕）并記錄、評分，評分標準見表1。若3 項指標的總分大于5 分，即判斷造模成功。

表1 大鼠鼻炎癥狀評分標準Table 1 Scoring standard of rhinitis symptoms in rats

1.5.3 大鼠脾臟指數 給藥結束當天，大鼠頸椎脫臼處死后，解剖取全脾稱質量，計算脾臟指數。脾臟指數（%）= 大鼠脾質量/大鼠體質量×100%。

1.5.4 鼻黏膜組織病理學觀察 給藥結束后，將大鼠頸椎脫臼處死，收集鼻黏膜組織制片，分別用蘇木素-伊紅（HE）和天狼猩紅（Sirius Red）染色，顯微鏡下觀察鼻黏膜組織病理學改變。

1.5.5 ELISA 法檢測大鼠血清中IL-4、IFN-γ水平 給藥結束后，用水合氯醛麻醉大鼠，眼底靜脈叢取血，離心收集血清，儲存于-80 ℃。參照試劑盒說明書檢測血清中IL-4、IFN-γ水平。

1.5.6 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測大鼠鼻黏膜組織中TSLP、OX40L 的mRNA表達水平 給藥結束后，處死大鼠，取新鮮鼻黏膜組織10 mg，加入TRIzol 裂解液充分研磨，提取總RNA，再逆轉錄成cDNA。以cDNA 為模板，進行 PCR 檢測 TSLP、OX40L 的 mRNA 表達水平。總體系20 μL：10 μL SYBR Green Supermix，正反向引物各0.5 μL，RNase-free water 8 μL，模板cDNA 1 μL。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃30 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算TSLP、OX40L mRNA 的相對表達量。引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Table 2 Primer sequences of PCR

1.6 統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模結果判斷及各組大鼠變應性鼻炎癥狀總分比較模型大鼠進食量明顯減少，精神萎靡，活動量減少，毛色枯黃，呼吸音稍粗，大便偏稀，籠內無明顯異味，體溫偏高，變應性鼻炎癥狀總分＞5 分。表明造模成功。圖1 結果顯示：與正常組比較，模型組變應性鼻炎癥狀總分升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠變應性鼻炎癥狀總分顯著降低（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明黃芪多糖可有效改善變應性鼻炎大鼠鼻癢、噴嚏、流涕等鼻部過敏癥狀。

圖1 各組大鼠變應性鼻炎行為學總分比較（±s，N=10）Figure 1 Comparison of the total behavioral scores of rat allergic rhinitis in various groups（±s，N=10）

2.2 各組大鼠脾臟指數比較圖2 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠脾臟指數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠脾臟指數顯著降低（P＜0.05），且2 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明黃芪多糖可提高變應性鼻炎大鼠免疫功能。

圖2 各組大鼠脾臟指數比較（±s，N=10）Figure 2 Comparison of the rat spleen index in various groups（±s，N=10）

2.3 各組大鼠鼻黏膜組織病理學變化比較圖3、4結果顯示：正常組鼻黏膜上皮細胞排列整齊，基底膜完整，可見少量炎癥細胞浸潤，膠原沉積較少。模型組鼻黏膜上皮不連續，部分基底膜脫落，部分纖毛上皮脫落，可見大量炎癥細胞浸潤和明顯的膠原沉積。與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組鼻黏膜上皮細胞排列完整，基底膜完整，少量炎癥細胞浸潤，膠原沉積明顯減少。

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織病理學變化比較（HE染色，×200）Figure 3 Comparison of the pathological features of rat nasal mucosa in various groups（by HE staining，×200）

圖4 各組大鼠鼻黏膜組織病理學變化比較（天狼猩紅染色，×200）Figure 4 Comparison of the pathological features of rat nasal mucosa in various groups（by Sirius Red staining，×200）

2.4 各組大鼠血清中IL-4、IFN-γ水平比較圖5結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清中的IL-4 水平顯著升高（P＜ 0.05），IFN-γ 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠血清中的IL-4 水平顯著降低（P＜0.05），IFN-γ 水平顯著升高（P＜ 0.05），且2 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠血清中IL-4（A）、IFN-γ（B）水平比較（±s，N=10）Figure 5 Comparison of the serum levels of IL-4，IFN-γ in various groups（±s，N=10）

圖6 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP mRNA（A）、OX40L mRNA（B）相對表達量比較（±s，N=8）Figure 6 Comparison of the mRNA expression levels of TSLP，OX40L in rat nasal mucosa of various groups（±s，N=8）

2.5 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP mRNA、OX40L mRNA表達水平比較圖6結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織的TSLP mRNA、OX40L mRNA 相對表達量均明顯升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和黃芪多糖組大鼠鼻黏膜組織的TSLP mRNA、OX40L mRNA 相對表達量均明顯降低（P＜0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究參考西醫臨床癥狀指標以及曾斌[9]建立的中醫“四診合參”大鼠肺氣虛寒行為學評價指標，建立肺氣虛型變應性鼻炎復合動物模型，該模型動物癥狀評價指標可較好地模擬變應性鼻炎典型臨床特征[11]。中醫學認為變應性鼻炎的病位在鼻，主要與肺、脾、腎密切相關。脾虛則失健運，水谷之精上升乏門，頭面清竅失養，無力御邪，外邪異氣可經口鼻之竅侵襲人體而致鼻鼽發生。脾臟作為最大的免疫器官，其脾臟指數的高低可初步估計脾臟免疫功能的強弱。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠出現精神萎靡、毛色枯黃、大便偏稀、進食量減少等明顯的肺氣虛證候表現，鼻部過敏癥狀明顯，脾臟指數明顯升高（P＜0.05）。提示煙熏法與OVA致敏可成功建立肺氣虛型變應性鼻炎大鼠模型，且變應性鼻炎大鼠免疫功能降低。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠肺氣虛寒證候表現有所改善，鼻部過敏癥狀減輕，脾臟指數明顯降低（均P＜0.05）。提示黃芪多糖可減輕肺氣虛型變應性鼻炎大鼠的過敏性癥狀，提高脾臟組織免疫力。

變應性鼻炎的鼻黏膜存在組織重塑現象，其中上皮細胞損傷和基膜膠原沉積是組織重塑的重要特征[12]。變應性鼻炎是由抗原引起的鼻黏膜變應性炎癥，病程較長，由于炎癥因子的持續作用，導致上皮不能修復而使得黏膜上皮發生形態變化，如纖毛缺失和部分上皮細胞脫落，同時亦引起黏膜下膠原纖維增生。組織重塑一旦發生往往難以逆轉，早期藥物干預對變應性鼻炎治療非常重要。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織重塑現象明顯；與模型組比較，黃芪多糖組鼻黏膜上皮細胞排列完整，基底膜完整，少見炎癥細胞浸潤，膠原沉積明顯減少。提示黃芪多糖可減輕變應性鼻炎鼻黏膜病理損傷，緩解鼻黏膜組織重塑現象。

TSLP 是一類由上皮細胞分泌的新型IL-7 樣細胞因子，在過敏性炎癥條件下呈高表達，是啟動過敏性炎癥的重要因子[13]。TSLP 信號通路的下游是OX40和其配體OX40L，它們是一對協同刺激分子。OX40L 是一種表達在成熟樹突狀細胞、巨噬細胞和活化的T、B 細胞表面的II 型跨膜糖蛋白，與OX40 在一些系列記憶T 細胞活動中相互作用，并維持效應T 細胞的存活和增殖，對Th1、Th2 細胞的分化過程起關鍵作用，TSLP-OX40L被認為是啟動和維持變應性鼻炎中Th2型免疫應答的重要信號通路[14]。TSLP 在過敏性炎癥中通過激活髓樣樹突狀細胞（DC）以產生OX40L，從而觸發Th2 炎癥反應[15]。以Th2 免疫反應占優勢所引起的Th1/Th2免疫失衡是誘發變應性鼻炎的主要發病機制[16]。Th1細胞主要介導細胞免疫應答，通過釋放IFN-γ等細胞因子來抑制Th2細胞活化，而Th2細胞主要介導體液免疫應答，通過產生IL-4 等細胞因子來抑制Th1細胞分化。當Th1細胞釋放的IFN-γ等細胞因子不足時，Th2細胞出現亢進現象，產生大量IL-4[17]，進而引起Th1/Th2 平衡失調，加重變應性鼻炎過敏性炎癥反應。本研究結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜TSLP、OX40L mRNA表達量顯著升高，血清IL-4 水平升高、IFN-γ 水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠鼻黏膜TSLP、OX40L mRNA 表達量明顯下降，IL-4 水平明顯降低，IFN-γ 水平明顯升高（均P＜0.05）。提示黃芪多糖可能通過下調TSLP、OX40L mRNA表達，抑制Th2細胞分化信號，減輕變應性鼻炎中Th2炎癥反應。

綜上所述，黃芪多糖對肺氣虛型變應性鼻炎大鼠鼻黏膜炎性癥狀具有明顯的緩解作用，其機制可能與調控TSLP、OX40L mRNA 表達及相關細胞因子水平有關。可為黃芪多糖在臨床治療變應性鼻炎的推廣應用提供實驗依據。