基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子生物學(xué)探討溫下方治療肺癌的作用機(jī)制

周瑩， 張韌， 黃意勉， 廖錦彬， 余泳儀， 羅海燕， 黃少偉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州 510095）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國居于惡性腫瘤之首，現(xiàn)仍有不斷上升的趨勢，死亡率居高不下，約80%的患者就診時(shí)已屬中晚期，化療為其主要治療手段，但成功率普遍不高[1-3]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的作用特色，應(yīng)用中醫(yī)辨證論治治療肺癌，在穩(wěn)定病灶、延長生存時(shí)間、改善生存質(zhì)量等方面具有一定的優(yōu)勢[4]。本課題組查閱文獻(xiàn)[5-7]，篩選出人參、大黃、附子、當(dāng)歸等4味中藥為治療肺癌的常用藥物，但其具體作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)等學(xué)科的發(fā)展及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的完善，對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，通過高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)構(gòu)建“藥物-成分-基因-疾病”之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)信號(hào)關(guān)系的新興學(xué)科[8]。為進(jìn)一步探討人參、大黃、附子、當(dāng)歸所組成的溫下方治療肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，以期為臨床治療肺癌提供新思路及有效方藥，同時(shí)也為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 溫下方的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制

1.1資料與方法

1.1.1 藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將溫下方藥物名稱“大黃”“附子”“當(dāng)歸”“人參”輸入到TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），使用口服生物利用度值（Degree）大于20%和藥物相似性評(píng)價(jià)值大于0.18 的限定條件對得到的藥物活性成分進(jìn)行篩選，得到藥物的有效活性成分。利用Uniport 數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)分子名稱（Molecule Name）選項(xiàng)，獲得靶點(diǎn)基因名（Gene Symbol）。通過Cytoscape軟件進(jìn)行藥物成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.1.2 肺癌疾病的相關(guān)靶點(diǎn)檢索 利用TTD數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）進(jìn)行肺癌的相關(guān)靶點(diǎn)檢索，并利用Uniport 數(shù)據(jù)庫得到相對應(yīng)的基因名。

1.1.3 溫下方藥物活性成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及基因本體論（GO）注釋與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析 將溫下方藥物有效成分靶點(diǎn)的基因名輸入到String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)。同法，得到肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相關(guān)作用關(guān)系數(shù)據(jù)。分別將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 軟件，得到活性成分靶點(diǎn)和肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。將這2個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，得到藥物有效成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。利用該網(wǎng)絡(luò)中所有靶點(diǎn)的Degree 值，得到溫下方藥物有效成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中重要靶點(diǎn)的信息。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對篩選出來的重要靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析。

1.2結(jié)果

1.2.1 溫下方活性成分與成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的溫下方有效活性成分有107種，其中大黃有29 種成分，附子有27 種成分，當(dāng)歸有4 種，人參有47 種成分。將有效活性成分輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫中，得到成分靶點(diǎn)共112個(gè)。由于有些成分靶點(diǎn)同時(shí)能夠被多種成分結(jié)合，而一個(gè)成分同時(shí)能夠與多種成分靶點(diǎn)結(jié)合，而有些有效成分卻沒有相應(yīng)的結(jié)合靶點(diǎn)，最后獲得32 個(gè)成分有其相對應(yīng)的作用靶點(diǎn)。見表1。

利用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物-成分和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1 和圖2。圖1 共涉及35 個(gè)節(jié)點(diǎn)，34 條邊。藍(lán)紫色六邊形代表溫下方組成藥物，粉紫色六邊形代表32 個(gè)藥物活性成分，邊代表藥物與活性成分之間的關(guān)聯(lián)。圖2 共涉及172 個(gè)節(jié)點(diǎn)，604條邊。六邊形代表藥物活性成分，圓圈代表成分靶點(diǎn)，邊代表成分與成分靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)。

1.2.2 肺癌相關(guān)靶點(diǎn)信息 從TTD數(shù)據(jù)庫里收集到有關(guān)肺癌的疾病靶點(diǎn)一共有77 個(gè)：TPBG、MMP2、MMP9、ALK、PDGFRA、BCL2、BIRC5、FGFR1、PDGFRB、 BRAF、 CEACAM5、 CDK1、 CDK7、CDK9、CDK4、COX17、DRD2、TOP1、MAP2K1、HSP90B1、 EGFL7、 EGFR、 FANCF、 HPSE、HGF、 HDAC1、 IGF1R、 ITGB1、 IL2、 IL4R、MMP1、KIF11、KDM1A、CSF1、MMP12、MARK3、MMP7、MAGEA3、MAGEC1、MAGEC2、MAD1L1、BAD、CLU、EIF4E、HSPB1、PRKCA、OPRM1、NTSR1、 NFE2L2、 CTAG1A、 P2RY2、 PDCD1、PPARG、PECAM1、FNTB、FNTA、ABL1、RET、AKT1、ERBB2、ERBB3、CHEK1、PLK1、ALB、SSTR2、 SKP2、 S1PR1、 TYMS、 TLR9、 TUBB3、PRAME、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TUSC2、MDM2、FLT1、KDR。

表1 溫下方有效活性成分Table 1 Active compounds in Warm Purgative Recipe

圖1 溫下方成分網(wǎng)絡(luò)Figure 1 The ingredient network of Warm Purgative Recipe

圖2 溫下方成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The ingredient-target network of Warm Purgative Recipe

1.2.3 溫下方藥物有效成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的分析 通過Cytoscape軟件，獲得成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。見圖3。圖3 共涉及170 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 145 條邊。圓圈大小和顏色深淺代表靶點(diǎn)蛋白相互作用的密切程度，橘紅色圓圈節(jié)點(diǎn)代表符合篩選條件的39 個(gè)重要靶點(diǎn)。邊代表靶點(diǎn)間的相互關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)大小代表Degree 值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，對應(yīng)的Degree 值越大。

圖3 溫下方與肺癌蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Proteins interaction network of Warm Purgative Recipe against lung cancer

1.2.4 39 個(gè)重要靶點(diǎn)的GO 注釋與KEGG 通路分析 收集到39個(gè)重要靶點(diǎn)經(jīng)過GO注釋與KEGG通路分析后，按P值從小到大排序，取前20個(gè)GO注釋信息（包括前20 個(gè)生物過程注釋，前20 分子功能注釋，前20個(gè)細(xì)胞組成注釋）和前20條KEGG通路信息，具體見圖4 ～7 和表2。在圖中，圓圈的大小代表參與該生物過程，或該分子功能，或該細(xì)胞組成，或該通路的靶蛋白基因數(shù)目的多少，圓圈越大，基因數(shù)目越多；顏色代表P值的大小，顏色由綠變紅對應(yīng)的P值越大；Rich factor 和P值代表靶蛋白基因的富集程度，Rich factor 和P值越大，富集程度越高。

2 細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.1材料與方法

2.1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人屬非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。將非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖4 重要靶點(diǎn)GO注釋——生物過程Figure 4 GO enrichment analysis of key targets—biological processes

圖5 重要靶點(diǎn)GO注釋——細(xì)胞組成Figure 5 GO enrichment analysis of key targets—cellular components

2.1.2 試劑與儀器 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（德國Biofroxx 公司）；UNIQ-10 柱式 TRIzol 總 RNA 抽提試劑盒（上海生工生物公司）；GeneRuler DNA Ladder Mix、 Maxima Reverse Transcriptase（美 國Thermo Scientific 公司）。全波長掃描多功能酶標(biāo)儀（上海美谷子儀器有限公司）；StepOne 型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

圖6 重要靶點(diǎn)GO注釋——分子功能Figure 6 GO enrichment analysis of key targets—molecular functions

圖7 重要靶點(diǎn)KEGG通路分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

表2 KEGG通路靶點(diǎn)信息Table 2 Data of KEGG pathway targets

2. 1. 3 含藥血清的制備 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠10 只，體質(zhì)量（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下飼養(yǎng)。溫下方組成為人參30 g、大黃40 g、附子40 g、當(dāng)歸20 g。中藥材購于廣州金芝中藥飲片有限公司。2 次水煎、濃縮制成含生藥量為1 g/mL 的藥液。大鼠給藥前稱質(zhì)量，按照每只大鼠1 mL/100 g 灌胃，每天2 次，連續(xù)4 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。末次給藥1 h后麻醉、腹主動(dòng)脈采血，分離血清，水浴滅活，微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ蒙鲜龊幯搴蚏PMI 1640培養(yǎng)基分別配制體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%的含藥血清。同法，給予大鼠生理鹽水灌胃制備空白血清。

2. 1. 4 MTT 實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞融合度為70%左右時(shí)，吸去培養(yǎng)液，分別加入5%、10%、20%含藥血清，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，加入20 μL的MTT后，37 ℃孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO 溶液，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm 波長處測定吸光度值。

2.1.5 熒光定量PCR 按照UNIQ-10 柱式TRIzol總RNA 抽提試劑盒的操作說明抽提各組細(xì)胞總RNA。AKT 上游引物序列5’- GAGGATGCCAAGG AGATCAT-3’，下游引物序列5’- CTGTGCCACT GGCTGAGTAG-3’；β-actin 上游引物序列5’-CC TCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物序列5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將制備好的cDNA 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。作熔解曲線，所有數(shù)值與內(nèi)參（β-actin）作△Ct，以2-△△Ct法分析AKT 的mRNA表達(dá)水平。

2.1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2結(jié)果

2.2.1 溫下方對A549細(xì)胞增殖的影響 表3結(jié)果顯示：與空白血清組比較，5%、10%、20%含藥血清組A549 細(xì)胞抑制率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且具有濃度依賴性。

2. 2. 2 溫下方對A549 細(xì)胞AKT mRNA 水平的影響 圖8 結(jié)果顯示：與空白血清組比較，10%、20%含藥血清組A549 細(xì)胞AKT mRNA 水平降低（P＜0.05），且具有濃度依賴性。

表3 溫下方對A549細(xì)胞增殖的影響Table 3 Effects of Warm Purgative Recipe on proliferation viability of A549 cells （x ± s，N=8）

圖8 溫下方對A549細(xì)胞AKT mRNA 表達(dá)水平的影響（x± s，N=8）Figure 8 Effects of Warm Purgative Recipe on AKT mRNA expression level in A549 cells（x ± s，N=8）

3 討論

肺癌的形成與陽氣不足、寒凝瘀滯有關(guān)，如《靈樞·百病始生篇》云：“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣。”[5]溫下方由附子、大黃、人參、當(dāng)歸等4味中藥組成。附子溫散寒凝，宣通冷積，補(bǔ)火助陽；大黃瀉下通便，蕩滌里實(shí)，活血袪瘀；人參大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)脾益肺；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤燥滑腸。四藥合用，共成溫通寒積之劑，針對陽虛陰盛、邪毒內(nèi)結(jié)之肺癌，恰對病機(jī)[5]。

本研究分析了溫下方各味中藥的有效成分，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵藥物是β-谷甾醇、山柰酚、延胡索乙素、豆甾醇、大黃素等。β-谷甾醇是大黃、人參、當(dāng)歸中的有效成分，山柰酚和延胡索乙素是人參的有效成分，豆甾醇是人參、當(dāng)歸中的有效成分，大黃素是大黃中的有效成分。藥理學(xué)研究表明：β-谷甾醇通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用[9]，還能調(diào)節(jié)人肺癌A549 細(xì)胞增殖及凋亡[10]；山柰酚抗腫瘤作用明顯，高攝入山柰酚會(huì)降低晚期大腸腺瘤的復(fù)發(fā)，體外實(shí)驗(yàn)表明，山柰酚對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 具有增殖抑制作用[11]；延胡索乙素在體外可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251MG的增殖、促進(jìn)凋亡，在體內(nèi)顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤組織增長，延長荷瘤小鼠生存時(shí)間[12]；豆甾醇具有抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[13]；大黃素處理A549 細(xì)胞后，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-AKT）、Bcl-2的表達(dá)量明顯減少，Bad 和cleaved-caspase-3 的表達(dá)水平明顯增加，大黃素通過調(diào)控AKT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡[14]。

本研究通過藥物有效成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的分析得到了39 個(gè)重要靶點(diǎn)。通過GO功能富集和KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)的基因富集到了與癌癥有直接關(guān)系的通路上，包括癌癥通路、癌癥蛋白多糖通路、非小細(xì)胞肺癌等，另一大部分主要調(diào)控信號(hào)通路，包括PI3K-AKT 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，本研究重點(diǎn)討論已經(jīng)實(shí)驗(yàn)或文獻(xiàn)報(bào)道驗(yàn)證了的AKT1、Bcl-2、TP53、CDK1 靶點(diǎn)。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，亦稱蛋白激酶B（PKB），由3 種同種型（AKT1，AKT2 和AKT3）組成，在主要細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞大小、細(xì)胞周期進(jìn)程、葡萄糖代謝調(diào)節(jié)、基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和新血管形成等。AKT 通過介導(dǎo)的細(xì)胞生長因子，并通過促凋亡蛋白的失活阻斷細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活[15-19]。Bcl-2 這一基因家族主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)，可以調(diào)控線粒體膜通透性，釋放凋亡因子細(xì)胞色素C 和激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)控因子[20]。TP53 基因是重要的抑癌基因之一，其編碼的腫瘤抑制蛋白p53 能夠使許多基因保持其穩(wěn)定性，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、衰老，避免疾病產(chǎn)生，被稱為“基因守護(hù)者”[21]。其編碼的p53 蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可以通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來應(yīng)對基因毒性應(yīng)激、癌基因信號(hào)激活以及DNA 損傷等不利因素[22]。周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）是調(diào)控細(xì)胞周期的核心分子，對細(xì)胞周期的調(diào)控至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、上皮性卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤中CDK1 功能失調(diào)，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素[23]。

為進(jìn)一步驗(yàn)證溫下方治療肺癌的作用靶點(diǎn)，本研究觀察了溫下方含藥血清對A549 細(xì)胞AKT mRNA水平的影響，結(jié)果顯示：溫下方含藥血清能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，可下調(diào)AKT mRNA 表達(dá)水平，且呈濃度依賴性。

綜上所述，溫下方具有多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的作用特點(diǎn)。由于人力、物力等條件限制，本研究細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)只做了AKT 靶點(diǎn)，其他未驗(yàn)證的靶點(diǎn)留待后續(xù)研究進(jìn)行。