NLRP3與炎癥因子及急性缺血性卒中預(yù)后的相關(guān)性研究

陽(yáng)敏燕，王孟坤

缺血性腦卒中又稱(chēng)腦梗死，是指因各種原因阻斷了腦部血液供應(yīng)，引發(fā)腦組織缺氧、缺血性壞死，繼而出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失的一類(lèi)疾病[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是缺血性損傷的重要組成部分之一[2]。而NLRP3作為一種參與腦缺血再灌注損傷過(guò)程的蛋白復(fù)合物，最近被研究發(fā)現(xiàn)，其活性的上調(diào)可以引起IL-1β、IL-18、caspase-1等炎癥因子的釋放增加[3,4]，隨后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥，引起神經(jīng)元損害，并加重腦損傷[5]。然而，NLRP3作為炎癥因子上游重要的通路調(diào)控因子，在人體中尚未得到充分的研究。在本研究中我們引入臨床上常見(jiàn)易得的指標(biāo)mRS評(píng)分以及主要炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α，探討NLRP3與炎癥及急性缺血性卒中預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究序貫性納入2017年12月-2018年6月收治于成都市第四人民醫(yī)院內(nèi)科病房首次確診的急性腦梗死的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡在 55～75 歲之間；(2)符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》中急性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(3)發(fā)病6～72 h內(nèi)入院；(4)經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)或磁共振成像 (MRI)結(jié)果確診為急性腦梗死患者。 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)短暫性腦缺血、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、顱內(nèi)血腫及其他出血性疾病者；(2)合并嚴(yán)重的感染；(3) 合并嚴(yán)重心、肝、 腎功能不全者；(4)伴有外傷、惡性腫瘤疾病者；(5)隨訪(fǎng)中丟失或退出研究的患者。患者入院后均予以常規(guī)抗栓、調(diào)節(jié)血脂水平、控制血壓等對(duì)癥支持治療。所有患者隨訪(fǎng)3個(gè)月，最終71人完成隨訪(fǎng)，并最終納入研究。同時(shí)從我院體檢中心招募38名健康志愿者作為對(duì)照。兩組研究對(duì)象的性別、年齡差異不顯著(P>0.05)，具有可比性。 本研究經(jīng)成都市第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。所有參與者或其親屬之前均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集 測(cè)定兩組研究對(duì)象的NLRP3 mRNA水平。于發(fā)病后第3～72 h采取靜脈血2 ml，使用RT-qPCR檢測(cè)NLRP3 mRNA水平。定量RT-qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物及mRNA表達(dá)率使用2ΔΔCt測(cè)定，以GADPH作為內(nèi)源性對(duì)照計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列：NLRP3 Upstream F-5’-AAAGCCAAGAATCCACAGTGTAAC-3’，NLRP3 Downstream R-5’-TTGCCTCGCAGGTAAAGGT-3’；GAPDH Upstream F-5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，GAPDH Downstream R-5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。通過(guò)ELISA檢測(cè)血清炎癥因子(白細(xì)胞介素IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子TNF-α)表達(dá)水平，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 資料收集 收集所有參與者的臨床特征(年齡、性別)、當(dāng)前吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、糖尿病情況。

1.4 對(duì)患者治療效果和預(yù)后的評(píng)價(jià) 患者的恢復(fù)情況，采用改良RanKin量表，根據(jù)發(fā)病3個(gè)月后，患者對(duì)日常工作及生活的完成程度進(jìn)行計(jì)分，最低分為0分，最高分為6分。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料的收集以及一般因素的評(píng)定 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征顯示，AIS患者的平均年齡和對(duì)照組分別為(63.7±12.4)歲和(61.1±10.3)歲；AIS患者中女性28例(39.4%),男性43例(60.5%);對(duì)照組女性14人(36.8%),男性24人(63.2%)。AIS患者和對(duì)照組之間在年齡 (P=0.713)和性別 (P=0.321)方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。對(duì)于臨床基線(xiàn)資料，對(duì)照組的吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥、高尿酸血癥、糖尿病分別為12 (16.7%)、18 (16.7%)、14 (36.8%)、10 (26.3%)、5 (13.2%)、7 (18.4%)。AIS組則分別為22(30.9%)、27(38.0%)、33(46.5%)、35(49.3%)、19 (26.8%)、13 (18.3%)。與對(duì)照組相比，高血脂患者(P=0.030)和高尿酸患者(P=0.041)在AIS患者中增加，而吸煙(P=0.949)、飲酒(P=0.223)、高血壓病(P=0.537)、糖尿病(P=0.373)在兩組間沒(méi)有觀察到明顯差異。此外，與正常對(duì)照組相比，AIS組NLRP3 mRNA(P<0.01)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

2.2 NLRP3水平與mRS評(píng)分的相關(guān)性 為了評(píng)估NLRP3作為生物標(biāo)志物對(duì)于AIS患者恢復(fù)情況的預(yù)測(cè)效能，我們對(duì)發(fā)病3個(gè)月后患者的恢復(fù)情況進(jìn)行了mRS評(píng)分。結(jié)果顯示，AIS組的mRS評(píng)分為(2.6±1.9)。進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)性分析我們還發(fā)現(xiàn)，NLRP3 的mRNA水平與mRS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.357,P=0.002)，提示血液中NLRP3 mRNA水平越高的AIS患者預(yù)后越差(見(jiàn)圖1)。

2.3 AIS患者血清炎癥因子的表達(dá)水平 為了了解NLRP3潛在的下游炎癥因子表達(dá)情況，我們通過(guò)ELISA檢測(cè)了血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。結(jié)果顯示，AIS組IL-1β、IL-6、TNF-α 濃度明顯高于正常對(duì)照組，P值均<0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (見(jiàn)表2) 。

2.4 AIS患者NLRP3與炎癥因子的相關(guān)性 為了明確NLRP3與IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的關(guān)系，我們對(duì)它們進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，AIS患者的NLRP3 mRNA水平與炎癥因子IL-1β(r=0.31,P=0.016)濃度呈正相關(guān)，而與IL-6 (r=0.07,P=0.751),TNF-α(r=0.14,P=0.186)無(wú)明顯相關(guān)性，表明可能是炎癥因子IL-1β介導(dǎo)了NLRP3的致病過(guò)程。

表1 人口學(xué)特征和臨床基線(xiàn)資料(n,%)

表2 兩組血清炎癥因子水平比較

圖1 NLRP3與mRS評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，先天免疫反應(yīng)在組織損傷或病原體入侵后的病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其亦被稱(chēng)為神經(jīng)性炎癥，并以星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活為特征。越來(lái)越多的研究表明，炎癥是介導(dǎo)血管疾病病理生理的一個(gè)關(guān)鍵因素，包括腦血管疾病[7]。腦卒中患者血液中炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等)水平通常增高，而如果炎癥因子表達(dá)水平的急劇升高也常常提示預(yù)后不良[8]。炎癥因子與腦卒中患者的預(yù)后密切相關(guān)[2]。當(dāng)患者發(fā)生腦灌注損傷時(shí)，機(jī)體會(huì)釋放出IL-1β、TNF-α等炎癥因子，觸發(fā)白細(xì)胞累積和中性粒細(xì)胞活化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞趨化。同時(shí)其還能引發(fā)氧化代謝物的產(chǎn)生，釋放出神經(jīng)毒性物質(zhì)，加重對(duì)腦組織的損傷。而隨著腦損傷程度的加重，又可進(jìn)一步誘導(dǎo)血清IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放。與既往研究報(bào)道一致，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AIS患者血液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯高于正常對(duì)照組，該結(jié)果證實(shí)了炎癥因子在腦梗死發(fā)病過(guò)程中的重要角色。眾所周知，類(lèi)節(jié)點(diǎn)受體(NLRs)是一類(lèi)胞質(zhì)傳感器或受體，它們對(duì)各種病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)作出反應(yīng)，這一反應(yīng)與微生物和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)有關(guān)。而其中，NLRP3是各種研究的熱點(diǎn)，也是目前研究最多的一類(lèi)NLRs，體外研究中表明，其在缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)中起重要作用[9]。NLRP3是一種新近發(fā)現(xiàn)的參與腦缺血再灌注損傷過(guò)程的蛋白復(fù)合物，NLRP3的激活可以引起IL-1β、IL-18、caspase-1等炎癥因子的釋放[3,10]。而NLRP3 siRNA可顯著減少的NLRP3表達(dá)以及其下游炎癥因子，同時(shí)也減少梗死體積,改善神經(jīng)系統(tǒng)損害的結(jié)局[11]。本研究測(cè)定了NLRP3在急性腦梗死患者血液中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，急性腦梗死的血漿中NLRP3 mRNA水平明顯增高。我們進(jìn)一步利用相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)，NLRP3 與炎癥因子IL-1β的表達(dá)具有正相關(guān)性，表明NLRP3確實(shí)是可能通過(guò)激活I(lǐng)L-1β等相關(guān)炎癥因子參與的AIS的疾病進(jìn)展。為了評(píng)估NLRP3作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)AIS患者預(yù)后的潛力，我們對(duì)起病3個(gè)月后的患者進(jìn)行了隨訪(fǎng)，采用改良RanKin對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示AIS患者的NLRP3 mRNA水平與mRS評(píng)分呈正相關(guān)，提示NLRP3的表達(dá)越高，AIS患者預(yù)后越差。推測(cè)可能的機(jī)制是：(1)NLRP3觸發(fā)了炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致了預(yù)后的惡化；(2)NLRP3可能激活或抑制了某些信號(hào)通路導(dǎo)致機(jī)體對(duì)抗栓藥物產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，抑制了治療效果，導(dǎo)致了AIS預(yù)后的惡化。但其潛在的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，血液中NLRP3轉(zhuǎn)錄水平越高的AIS患者預(yù)后越差；此外，可能是炎癥因子IL-1β介導(dǎo)了NLRP3的致病過(guò)程。在今后的臨床工作中，對(duì)于缺血性腦卒中患者，尤其是入院后NLRP3值較高的患者，應(yīng)早期重視并密切監(jiān)測(cè)。同時(shí)，NLRP3作為潛在的治療靶點(diǎn)，其參與腦卒中的分子機(jī)制研究也應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步完善。