Hh信號通路相關蛋白表達對老年局部晚期非小細胞肺癌放化療敏感性的預測價值

陳華林 楊東紅 王永存 羅怡平 李姝君 吳愛兵 楊志雄

(廣東醫科大學附屬醫院肺部腫瘤科，廣東 湛江 524023)

局部晚期非小細胞肺癌(LA-NSCLC)〔1〕是指伴有縱隔淋巴結或鎖骨上轉移、侵犯肺尖部或縱隔，而未發現遠處轉移的非小細胞肺癌(NSCLC)。絕大多數LA-NSCLC因腫瘤鄰近大血管或胸膜及淋巴結轉移等原因而失去手術機會，因此，同步放化療成為功能狀態佳、不可手術的LA-NSCLC患者標準治療方案〔2〕。但是由于放化療抵抗等原因，同步放化療對LA-NSCLC患者療效并不顯著，2年生存率不足30%〔3〕。在臨床實踐中也發現，放化療在不同個體的LA-NSCLC患者中存在差異，約有1/3患者效果并不明顯，這不但無助于臨床治療，甚至還會引起嚴重不良反應〔4〕。若在治療前可以預測患者對放化療的敏感性，就可以制定既有最佳療效又對正常組織損傷小的最佳治療方案。Hedgehog(Hh)信號通路是在脊椎動物組織分化、胚胎發育和器官形成中發揮重要作用的信號通路，最初認為當胚胎發育后成熟，Hh信號通路會自動關閉〔5〕。最新研究表明〔6〕，在肺癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞中Hh信號通路異常活化，并且該信號通路參與了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等過程。目前，針對Hh信號通路不同靶點的干預治療在惡性腫瘤治療中取得了良好的效果，但是其與LA-NSCLC放化療敏感性之間的研究罕見報道?；诖?，本研究首先檢測LA-NSCLC患者組織中Hh信號通路中關鍵蛋白：人類刺猬因子(Shh)、丁蛋白受體(Ptch)、膠質瘤相關癌基因同源蛋白(Gli)1表達，并隨訪患者放化療結局，旨在探討Shh、Ptch、Gli1對LA-NSCLC放化療敏感性的預測價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2016年7月至2017年7月廣東醫科大學附屬醫院腫瘤中心收治的60例LA-NSCLC患者作為研究對象，男34例，女26例，年齡60～75歲，平均(68.3±8.2)歲。納入標準：①有明確的病理診斷，且不能手術的LA-NSCLC患者(Ⅲa～Ⅲb)；②患者擬行放療同步化療；③治療前有可以測量的病灶；④預計生存期≥6個月；⑤治療前美國東部腫瘤協作組(ECOG)評分0～1分，第1秒用力呼氣容積(FEV1)>70%；⑥首次接受化療和放射治療；⑦年齡≥60周歲；⑧臨床資料和隨訪資料完整；⑨治療方案取得患者及家屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：①具有手術指征；②合并其他部位惡性腫瘤；③卡氏(KPS)評分<70 分；④既往接受過抗癌治療。另從醫院病理標本庫收集15例肺良性病變病理組織樣本作為對照，其中男10例，女5例，年齡63～78歲，平均(70.8±6.4)歲。

1.2樣本采集與檢測方法 LA-NSCLC患者中有42例為纖維支氣管鏡取病理，18例為CT穿刺取病理，肺良性病變均為纖維支氣管鏡取病理。樣本組織取出后，常規石蠟包埋，行兩步免疫組化染色法(試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，檢測操作嚴格按照試劑盒說明書，兔源性Shh、Ptch、Gli1多克隆抗體均購自美國Abcam公司，稀釋濃度均為1∶1 000。二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，抗原修復，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。由兩位病理醫師采用盲法閱片，采用半定量法計算染色評分，最終得分為染色強度×陽性細胞百分比。染色強度：0分為無染色；1分為弱染色；2分為中等染色；3分為強染色。陽性細胞百分比：0分為無染色；1分為陽性細胞比例<25%，2分為陽性細胞比例25%～50%；3分為陽性細胞比例51%～75%，4分為陽性細胞比例>75%。參考童未來等〔7〕報道，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分陽性()，9～16分為強陽性()；其中(-)為陰性表達，(+)、()、()為陽性表達。

1.3治療方法 LA-NSCLC患者擬行同步放化療，患者均接受局部放射治療，總劑量60 Gy，按照2.0 Gy/次常規分割，5次/w，共計照射30次?；颊邚姆暖煹?天開始接受全身化療，其中鱗癌患者采用順鉑+多西他賽(順鉑25 mg/m2，第1～3天；多西他賽75 mg/m2，第1天)，非鱗癌患者采用順鉑+培美曲塞(順鉑25 mg/m2，第1～3天；培美曲塞500 mg/m2，第1天)，每28天為1個周期，化療不少于3個周期。

1.4療效評價

1.4.1近期療效評價 化療3個周期后，采用胸上腹部CT評價類型，按照實體瘤的療效評價標準〔8〕(RECIST 1.1)，完全緩解(CR)：靶病灶消失，腫瘤標志物正常；部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小≥30%；疾病穩定(SD)：基線病灶長徑總和有所縮小，但未達PR；或有所增加，但未達PD；疾病進展(PD)：基線病灶長徑總和增加≥20%或出現新的病灶。其中CR+PR為放化療敏感組，SD+PD為放化療抵抗組。

1.4.2遠期療效評價 對患者進行常規隨訪，生存時間從放化療第1天開始計算，觀察患者總體生存率。

1.5統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗、χ2檢驗、Logistic回歸分析。部分圖形利用GraphPad Prism 7.0軟件繪制。采用Kaplan-Meier法繪制LA-NSCLC患者生存曲線，生存率的差異采用Log-rank法。Cox回歸模型分析影響患者生存的預后因素。

2 結 果

2.1Shh、Ptch、Gli1蛋白表達 LA-NSCLC組織Shh表達陽性率為70.0%(42/60)，Ptch陽性率為71.7%(43/60)，Gli1陽性率為78.3%(47/60)，肺良性病變組織分別為20.0%(3/15)、6.7%(1/15)和33.3%(5/15)，LA-NSCLC組織Shh、Ptch、Gli1蛋白陽性率明顯高于肺良性病變組織(χ2=12.500、20.908、11.429,均P<0.05)，見圖1。

圖1 LA-NSCLC組織和肺良性病變組織Shh、Ptch、Gli1蛋白表達(SP，×200)

2.2放化療敏感組和放化療抵抗組臨床資料比較 60例患者中CR 4例，PR 29例，SD 22例，PD 5例。按照近期療效分為放化療敏感組33例(CR+PR)和放化療抵抗組27例(SD+PD)。放化療敏感組Shh、Ptch、Gli1蛋白陽性率明顯低于放化療抵抗組(P<0.05)，兩組其余臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 放化療敏感組和放化療抵抗組臨床資料比較(n)

2.3影響放化療近期療效的危險因素分析 以對放化療是否敏感作為自變量，將各臨床資料代入多因素Logistic回歸模型，結果顯示，Shh、Ptch、Gli1蛋白表達是影響LA-NSCLC患者放化療近期療效的獨立危險因素(均P<0.05)，見表2。

表2 Logistic回歸分析影響LA-NSCLC放化療近期療效的獨立危險因素

2.4LA-NSCLC患者生存預后的Cox回歸分析 本研究隨訪截止日期為2019年5月31日，至末次隨訪，共有37例患者死亡。將相關指標納入Cox多因素回歸模型，結果顯示Shh、Ptch、Gli1表達陽性是LA-NSCLC患者不良預后的危險因素(均P<0.05)，見表3。

表3 LA-NSCLC患者生存預后因素的Cox回歸分析

2.5Shh、Ptch、Gli1表達與LA-NSCLC患者總體生存的關系 Shh、Ptch、Gli1表達陽性的LA-NSCLC患者總體生存時間較表達陰性者明顯縮短(均P<0.05)，見圖2。

圖2 Shh、Ptch、Gli1表達陽性和陰性LA-NSCLC患者生存曲線

3 討 論

Hh信號轉導通路通過一條復雜的信號轉導級聯反應來執行其生物學作用〔9,10〕，其中Shh信號蛋白在整個信號通路中發揮重要調節作用。當Shh信號蛋白表達下調時，Ptch抑制跨膜蛋白Smo表達，從而阻斷Hh信號通路。反之，當Shh與Ptch結合后，處于靜息狀態的Hh通路會并激活，同時啟動下游轉錄因子Gli1，參與調控細胞的增殖、分化和侵襲等過程。研究表明〔11〕，Hh信號通路活化與多種惡性腫瘤的發生和進展密切相關，通路效應蛋白在相應的腫瘤細胞和組織中存在異常表達。Ohta等〔12〕等發現Hh信號通路在彌漫性胃癌侵襲、轉移過程中起重要作用，其中Shh為關鍵分子，參與調控與EMT發生有關的分子的表達。Subramani等〔13〕發現Hh信號通路是通過激活 MMP-9 來促進胰腺癌細胞的侵襲、遷移能力，尤其Hh信號通路中的Gli1起主要作用。

Hh信號通路在NSCLC的研究較少，但是有限的報道中均提及了Hh信號通路在NSCLC中異常激活，并且可能參與了NSCLC的進展和遠處轉移。Fan等〔14〕在肺癌中觀察到Hh信號通路異常激活，Hh信號通路上調了腫瘤細胞的增殖活性。Giroux等〔15〕發現了Hh 通路產物與NSCLC診斷之間的關系，尤其是Shh和Gli1的表達與臨床病理因素和預后之間是有關聯的，因此Hh通路可作為NSCLC的診斷標志。本研究顯示，LA-NSCLC組織Shh、Ptch、Gli1蛋白陽性率明顯高于肺良性病變組織，說明Hh通路在LA-NSCLC中也呈活化狀態，有望成為一個新的治療靶點。Hh信號通路不但在腫瘤發生、發展和轉移中發揮重要作用，目前的少量研究同樣顯示Hh信號通路與放化療敏感性具有相關性。Sims-Mourtada等〔16〕報道稱，在43例有放化療治療抗拒的食管癌患者中，36例(83.7%)Hh信號激活且Gli1陽性，7例(16.3%)Gli1陰性，說明食管癌的放化療抗拒與Hh信號激活有關。本研究也發現，在LA-NSCLC患者中，放化療敏感組Shh、Ptch、Gli1蛋白陽性率明顯低于放化療抵抗組，并且Shh、Ptch、Gli1蛋白表達是影響LA-NSCLC患者放化療近期療效的危險因素。這一結果說明Shh、Ptch、Gli1等Hh信號通路關鍵蛋白可以作為LA-NSCLC同步放化療近期療效的預測指標，臨床醫生可以據此為患者制定個體化放化療方案。

Gu等〔17〕采用免疫組化學染色檢測了80例NSCLC患者組織標本中Hh通路效應蛋白的表達情況，結果發現所有Hh通路效應蛋白均呈高表達，并且相關蛋白表達水平越高，患者生存期越短，提示Hh信號通路可能與患者生存預后有關。Hh信號通路可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號和穩定細胞內p53、Bcl-2表達，通過抗凋亡作用降低對放化療的敏感性，從而降低腫瘤治療效果〔18,19〕。Jian等〔20〕報道稱，Hh信號通路抑制劑(Cyclopamine)預處理肺癌A549細胞可以增加細胞對射線的敏感性，間接提示Hh信號通路活化可能是肺癌放療抵抗的主要原因。本研究發現，雖然患者均接受了同步放化療，但是Shh、Ptch、Gli1表達陽性的LA-NSCLC患者總體生存時間明顯縮短，說明Hh信號通路也是影響患者遠期療效的因素之一。因此，LA-NSCLC患者治療前應評估Hh信號通路狀態，盡量選擇Shh、Ptch、Gli1表達均為陰性的患者接受放化療，有可能使其長期生存獲益。