肢體缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障的保護作用

陽昀 周茜 廖小明 劉開祥 李浩

(桂林醫學院 1第二附屬醫院神經內科，廣西 桂林 541199；2附屬醫院神經內科)

腦缺血再灌注(I/R)早期，由于血腦屏障(BBB)微結構受到損害，引起腦水腫、鈣超載、炎癥反應、自由基損害等改變，BBB通透性增加，造成神經元壞死、凋亡，再灌注損傷逐漸惡化；同時，現公認降低BBB通透性是治療再灌注損傷的有效手段〔1～4〕。2009年，Ren等〔5〕首次提出肢體缺血后處理(LPostC)對腦I/R損傷發揮神經保護作用，這給我們提供了新的可能。前期發現，LPostC可能通過抑制P38MAPK/ATF2途徑減少細胞凋亡，起到神經保護作用〔6〕。但是LPostC是否能夠通過降低BBB通透性實現神經保護作用？本實驗擬建立大鼠腦I/R損傷模型，探究LPostC是否通過促進閉鎖小帶蛋白(ZO)-1表達、阻抑水通道蛋白(AQP)-4表達來減弱BBB通透性、減輕組織水腫、縮小腦梗死區域，以期進一步闡明LPostC神經保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 主要試劑：2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自碧云天生物科技公司，伊文斯藍(EB)、兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體及兔抗大鼠AQP-4多克隆抗體均購自Sigma公司，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司，HRP標記羊抗兔二抗和HRP標記抗小鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實驗動物與分組 SPF級雄性SD大鼠45只，體重250～280 g(由桂林醫學院動物實驗中心提供)。隨機分為假手術(Sham)組、I/R組、LpostC組，每組15只。I/R組與LpostC組建立大腦中動脈I/R模型，LpostC組建立雙下肢LpostC模型。

1.3實驗模型制備 石蠟線栓法制備大腦中動脈I/R模型：電凝并游離左側頸外動脈，用頭端蘸有石蠟的魚線(φ=0.26 mm)從左側頸外動脈插入，深度18～20 mm，栓塞左側大腦中動脈。缺血2 h后，將線栓拔出1 cm，實現再灌注24 h。LPostC模型：在再灌注同時，雙側股動脈夾閉5 min，松開5 min，如此循環3次。

1.4方法

1.4.1腦組織含水量檢測 再灌注24 h后，稱量腦組織缺血側半球濕重，然后將其110℃烘烤24 h后稱量干重。按公式：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.2TTC法計算腦梗死體積 再灌注24 h后，腦組織冠狀位切5等份，平均厚度2 mm，1%TTC溶液染色，37℃避光孵育30 min，正常組織呈紅色，梗死區為白色，4%多聚甲醛固定，24 h后相機拍照，用Image-Pro Plus6.0軟件進行圖像分析。

1.4.3BBB通透性評判 根據EB滲出量評判BBB通透性。再灌注24 h后，2%EB溶液(4 ml/kg)注入大鼠股靜脈，1 h后生理鹽水灌流，斷頭取腦，取左側背外側新皮質稱重，隨后加入50%三氯乙酸溶液。勻漿和離心，取上清液稀釋。在分光光度計上測定620 nm處已知不同濃度EB的吸光值，根據標準曲線算出各組大鼠腦組織EB滲出量。

1.4.4Western印跡檢測ZO-1、AQP-4蛋白表達 再灌注24 h，斷頭取腦，剪取梗死側腦組織，加入RIPA裂解液，離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度。經12%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉法(200 mA，90 min)將蛋白質轉移到0.22 nm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗ZO-1(1∶1 000)、AQP-4(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，4℃搖床過夜，TBST洗膜，10 min，3次。二抗孵育1 h，TBST洗膜，10 min，3次。ECL法發光、顯影、定影。采用SensiAnsys軟件進行圖像分析。蛋白表達水平是用ZO-1、AQP-4灰度值與β-actin灰度值的比來表示，比值越大，則蛋白表達水平越高。

1.5統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組腦組織含水量比較 Sham組腦組織含水量最低；I/R組腦組織含水量明顯高于Sham組(P<0.05)；LPostC組腦組織含水量明顯低于I/R組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦含水量、腦梗死體積、EB滲出量比較

2.2各組腦梗死體積比較 Sham組無腦梗死；I/R組腦梗死體積明顯高于Sham組(P<0.05)；LPostC組腦梗死體積明顯小于I/R組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組腦梗死體積比較

2.3各組EB滲出量比較 Sham組EB滲出量最少；I/R組EB滲出量明顯高于Sham組(P<0.05)；LPostC組EB含量明顯低于I/R組(P<0.05)。見表1。

2.4各組ZO-1、AQP-4表達比較 Sham組ZO-1和AQP-4均有表達；與Sham組相比，I/R組ZO-1表達降低(P<0.05)，AQP-4表達增加(P<0.05)；與I/R組相比，LPostC組ZO-1表達增加(P<0.05)，AQP-4表達降低(P<0.05)。見圖2、圖3、表2。

圖2 各組ZO-1及AQP-4表達

圖3 各組AQP-4表達水平比較

表2 各組ZO-1、AQP-4表達含量比較

3 討 論

LPostC是指在腦I/R初期對遠端肢體加之反復短暫的缺血/再灌注刺激，誘導腦組織對缺血狀態產生耐受以抵抗致命打擊，進而達到神經保護作用〔1〕。課題組前期發現，LPostC對腦I/R損傷的保護作用與下調P38MAPK信號通路，抑制p-p38、p-AFT2的表達，抑制細胞凋亡有關〔6〕。本實驗結果發現，大鼠腦I/R損傷后進行LPostC可以減少EB滲出、減輕腦組織水腫，減少腦梗死體積，起到神經保護作用，這與課題組前期研究一致。

BBB由腦毛細血管內皮細胞及其間的緊密連接(TJ)、周細胞、星形膠質細胞末端和細胞外基質等構成，限制某些物質(多指有害物質)從血液進入腦脊液，對維持腦內環境的穩態具有重要意義〔7〕。腦I/R早期階段，BBB的結構就已被破壞，水腫液、毒性代謝產物、氧自由基等聚集在缺血區域，導致神經元壞死、凋亡。隨著研究的深入，學者們發現腦缺血再灌注損傷時ZO-1、AQP-4等蛋白參與BBB結構和功能的破壞，造成缺血性腦水腫。

TJ是BBB的重要結構，其開放與閉合狀態可影響BBB功能的變化；而TJ的狀態與其相關蛋白的表達密切相關。作為TJ主要構成蛋白，ZO-1承擔連接跨膜蛋白和細胞骨架蛋白的功能〔8〕。Wu等〔9〕發現在體外和體內腦缺血模型中，血管內皮生長因子通過LOC102640519/HOXC13/ZO-1途徑，阻抑ZO-1表達，從而使TJ功能障礙、BBB結構受損及腦組織損傷加劇。Liu等〔10〕在體外細胞缺血再灌注模型中證實提高ZO-1、Occludin的表達可以改善BBB功能。Jung等〔11〕報道電刺激針灸治療能夠減輕再灌注損傷，其相關機制與抑制活性氧、NAPDH氧化酶4及提高TJ蛋白ZO-1、Claudin-5表達有關。這提示ZO-1對于穩定BBB結構和功能至關重要，其表達可影響BBB通透性改變。因此，我們可以根據ZO-1表達變化判斷BBB結構是否被破壞。本研究結果表明LPostC可以使ZO-1表達增加來維持TJ結構及功能穩定，減弱BBB通透性，從而發揮神經保護作用。

AQP-4是特異性跨膜轉運水分子通道蛋白，其高度集中在腦實質與液體間隙(腦脊液、血液)交界處的細胞膜上，如毗鄰于微血管內皮細胞的星形膠質細胞足突上、室管膜細胞基底膜和室管膜下星形膠質細胞膜。所以AQP-4作為BBB組成的一部分，其表達的變化可以影響BBB結構和功能〔12〕。研究發現AQP-4主要參與腦內的水平衡、K+緩沖和體液的自身調節等，其異常表達與多種神經系統疾病所致的腦水腫關系密切〔13〕。Hirt等〔14〕發現AQP-4基因敲除小鼠腦缺血后腦組織損傷區域縮小、神經元壞死減少和神經炎性反應減輕。Popescu等〔15〕報道給予AQP-4抑制劑TGN-020預處理的大鼠腦缺血后腦梗死體積縮小。He等〔16〕證實4-甲氧基苯甲醇通過抑制AQP-4蛋白及增強TJ蛋白的表達來減輕腦缺血再灌注損傷。本實驗表明LPostC能夠阻抑AQP-4表達，修復BBB結構和功能的缺損，從而減少組織滲出、減輕水腫。