苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長凋亡的作用及機(jī)制

李旭 陳嵐 岳園 于軍

(1吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 長春 130021；2長春市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科；3吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肝癌是全球第六大常見癌癥〔1〕，近年來中老年肝癌發(fā)病率呈上升趨勢，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后不良，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅〔2〕。中國肝癌死亡占世界的53%，主要影響到中老年人〔3〕。肝癌幾乎總是由潛在的疾病引起，但這種疾病的來源在世界各地差別很大，包括乙型肝炎病毒(HBV)〔4〕、不良飲食和缺乏活動(dòng)〔5〕及真菌毒素〔6〕。肝癌通常預(yù)后差，5年生存率估計(jì)低于9%〔7〕。

苦參堿(Matrine)是傳統(tǒng)中藥苦參〔8〕中的一種重要成分〔9，10〕，它是一種喹啉類生物堿，其分子式為C15H24N2O，苦參堿已被驗(yàn)證具有廣泛的藥理作用〔11，12〕，如抗乙肝病毒治療慢性乙型肝炎等〔13〕。近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道苦參堿具有良好的抗癌活性〔14〕。本文擬分析苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長、凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與藥物 苦參堿(上海源葉生物科技有限公司)純度≥98%，環(huán)磷酰胺為上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司生產(chǎn))，胎牛血清(FBS，Biological industries)；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和增強(qiáng)型細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8(碧云天)。

1.2細(xì)胞株 HepG2肝癌細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3主要儀器設(shè)備 基礎(chǔ)電泳儀Bio-Rad，紫外透射儀：北京六一；凝膠成像分析系統(tǒng)：上海富山；聚合酶鏈反應(yīng)儀(PCR)，電熱恒溫培養(yǎng)箱：中儀國科(北京)科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-175，倒置熒光攝影分析顯微鏡LX71：奧林帕斯；BD公司流式細(xì)胞儀：ACCURI C6；全波長酶標(biāo)儀：瑞士Tecan。

1.4肝癌細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)。2～3 d換液1次，細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并按1∶2比例傳代。凍存細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞懸浮于含90%FBS、10%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM凍存液中。細(xì)胞培養(yǎng)傳代數(shù)在30～40代之內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5貼壁細(xì)胞 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μl，鋪板使待測細(xì)胞濃度為5×104/孔，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充。5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物。5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μl噻唑藍(lán)(MTT)溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD450 nm處測量各孔的吸光值。苦參堿配制為1 g/L的無菌溶液備用。用完全培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋制成濃度依次為0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0 mg/ml的苦參堿工作溶液備用。

1.6體外抑制肝癌HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/孔。接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μl，分別加入不同濃度苦參堿，每種濃度8個(gè)復(fù)孔，另設(shè)環(huán)磷酰胺對(duì)照，分別0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0 mg/ml 5個(gè)濃度，8個(gè)復(fù)孔。另設(shè)調(diào)零孔。培養(yǎng)板于37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h，加入20 μl/孔增強(qiáng)型CCK-8溶液，其他以此類推。同時(shí)用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和增強(qiáng)型CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱里繼續(xù)孵育0.5～4.0 h，分別在450 nm測定吸光度，分別取培養(yǎng)0.5 h、1.0 h、4.0 h分別用酶標(biāo)儀檢測，測得OD值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會(huì)因檢測的儀器有所不同。

1.7流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測肝癌細(xì)胞凋亡 (1)取6孔板以 5×104個(gè)/ml的濃度接種細(xì)胞懸液，200 μl/孔，設(shè)對(duì)照組(PBS組)和苦參堿組，細(xì)胞貼壁后按分組加入藥物，置培養(yǎng)箱孵育24 h后，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS 洗滌2遍，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃過夜。離心棄乙醇，PBS洗滌2遍，加入RNA酶，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶(PI)后4℃避光染色30 min。FCM分析各組的 DNA含量和細(xì)胞周期各時(shí)相的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。凋亡細(xì)胞為Annexin V標(biāo)記陽性，PI染色陰性。(2)調(diào)整待測肝癌HepG2細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞，1 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮。1 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌。將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液。加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min或4℃反應(yīng)30 min。加入300 μl結(jié)合緩沖液，再加入5 μl PI，即可上機(jī)檢測。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

環(huán)磷酰胺0.125 0、0.250 0 mg/ml時(shí)，苦參堿0.500 0、0.250 0 mg/ml時(shí)，對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制顯著(P<0.05)，見表1。經(jīng)過苦參堿處理后肝癌細(xì)胞凋亡明顯增加，并且隨著苦參堿濃度的增加細(xì)胞凋亡的比例也隨之升高。見圖1。

表1 不同濃度環(huán)磷酰胺、苦參堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞凋亡

3 討 論

苦參堿對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞類型〔15〕，包括肝癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌有較為明顯的抗腫瘤作用〔16～18〕。苦參堿通過抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡而顯示出抗腫瘤作用〔19〕，同時(shí)有引發(fā)細(xì)胞凋亡蛋白酶依賴的獨(dú)立程序細(xì)胞死亡的能力，顯示出化療的潛力。1995年苦參堿被中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準(zhǔn)為非小細(xì)胞肺癌、肝癌的抗癌藥物，并與其他抗癌藥物配伍使用〔20〕，苦參堿因此也被已用于治療肝病和保護(hù)肝功能，尤其是作為肝癌治療的輔助藥物。體內(nèi)和體外研究表明，苦參堿劑量依賴性降低了HepG2細(xì)胞的存活率，增加了凋亡率〔21，22〕?？鄥A在細(xì)胞周期的G0/G1階段明顯抑制HepG2細(xì)胞，提示細(xì)胞周期進(jìn)展遲緩可能是苦參堿抗增殖作用的機(jī)制之一〔23〕。不同濃度的苦參堿體外作用肝癌HepG2細(xì)胞株有抑制作用，苦參堿通過抑制線粒體自噬和PINK1/Parkin通路的新機(jī)制促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡〔24〕。