miR-877靶向TRIM72調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡

符洪犢 梁麗明

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？谑嗅t(yī)院心胸外二科，海南 海口 570208)

病毒性心肌炎(VMC)嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病和心源性猝死〔1〕。VMC的治療主要是抗炎、免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒治療〔2〕，尚未有特別有效的治療方法，如何快速有效靶向減輕VMC病癥是臨床急需解決的問題。三重基序(TRIM)72又稱MG53，是一種心臟和骨骼肌特異性TRIM家族蛋白，參與心臟、骨骼肌和其他組織的質(zhì)膜修復(fù)等過程〔3〕。TRIM72在心肌梗死大鼠心肌組織中的表達(dá)降低，PM2.5可能通過抑制TRIM72表達(dá)加重大鼠心肌梗死的程度〔4〕，說明其在心臟損傷中具有重要作用。miRNA在心肌炎中通過調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)通路等幾種重要的免疫和抗病毒途徑參與心臟損傷、炎癥反應(yīng)及心臟功能恢復(fù)〔5,6〕。miR-877在X射線造成的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞炎癥和曲伐沙星誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥中的表達(dá)水平升高〔7,8〕，藥物瑞巴派特通過抑制miR-877-5p 表達(dá)，減輕阿司匹林對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 的炎癥〔9〕。但miR-877在心肌細(xì)胞炎癥中的表達(dá)及其作用，且miR-877與TRIM72在心肌細(xì)胞炎癥中的關(guān)系目前還尚未可知。本研究探討miR-877對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥、凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自ATCC；胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，LPS、胰蛋白酶Trypsin購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；miR-877模擬物(miR-877)、miR-877抑制劑(anti-miR-877)、TRIM72小干擾RNA(si-TRIM72)和陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC、si-NC)及TRIM72野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；抗TRIM72、凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)、抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3抗體購(gòu)自Abcam公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，發(fā)光儀及PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、LPS處理和分組〔10〕細(xì)胞培養(yǎng)：將大鼠心肌細(xì)胞H9c2于含有10 %FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：濕度95%，37℃ 5%CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集細(xì)胞，消化傳代。

LPS處理和分組：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，根據(jù)文獻(xiàn)〔10〕，將細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 mg/L的LPS，進(jìn)行培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組：不加LPS，加入等體積的培養(yǎng)液；LPS組：加入終濃度為10 mg/L的LPS；實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行LPS處理。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞融合為一層時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，將等體積Lipofectamine2000和各組載體或核苷酸片段輕柔混勻，室溫孵育15 min，將混合液滴入到培養(yǎng)好的細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染或(和)LPS處理的各組H9c2細(xì)胞，用RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA。然后以RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，測(cè)定濃度和純度。取cDNA按照PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)miR-877和TRIM72。引物如下：miR-877上游引物為5′-TCCTCTTCTCCCTCCTCCCAG-3′，下游引物為5′-GGGAGGAGGGAGAAGAGGATT-3′；TRIM72 上 游 引 物 為5′-GGAACACCTGGATCCACTGA-3′，下 游 引 物 為5′-TACACTCTTCTCCTTGCGCA-3′；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。運(yùn)用IQ5TM Real-time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集轉(zhuǎn)染或(和)處理的各組H9c2細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，稀釋細(xì)胞為1×106個(gè)/ml，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，取100 μl Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC和 10 μl 碘化丙啶(PI)，室溫避光15 min，加入Annexin結(jié)合液400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 收集H9c2細(xì)胞，消化稀釋，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察若細(xì)胞融合為一層時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的TRIM72野生型(WT-TRIM72)和突變型(MUT-TRIM72)雙熒光素酶報(bào)告載體與miR-NC或miR-877分別共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞室溫裂解20 min，離心收集上清，檢測(cè)上清中熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.6Western印跡檢測(cè)TRIM72和凋亡相關(guān)蛋白 收集培養(yǎng)好的H9c2細(xì)胞，加入RIPA裂解液，孵育20 min，破碎細(xì)胞，收集蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。然后進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)醋酸纖維素(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(抗TRIM72抗體 1∶1 000，抗Bcl-2抗體1∶800，抗Bax抗體1∶1 200，抗活化caspase-3抗體1∶1 500)，4℃過夜，洗膜3次，加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LPS對(duì)心肌細(xì)胞中miR-877和TRIM72表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組心肌細(xì)胞中miR-877表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，TRIM72 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 TRIM72蛋白表達(dá)

表1 LPS對(duì)心肌細(xì)胞中miR-877和TRIM72表達(dá)的影響

2.2抑制miR-877表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá) 與對(duì)照組相比，LPS組的miR-877表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；與LPS+anti-miR-NC組相比，LPS+anti-miR-877組的miR-877表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見表2，說明LPS可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，大量產(chǎn)生炎癥因子；抑制miR-877表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2炎癥，降低炎癥因子的產(chǎn)生。

表2 抑制miR-877表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

2.3抑制miR-877表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，LPS組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和活化caspase-3表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)；與LPS+anti-miR-NC組相比，LPS+anti-miR-877組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和活化caspase-3表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖2和表3，說明LPS可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡，抑制miR-877表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞H9c2凋亡。

A:凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B:細(xì)胞凋亡流式圖

表3 抑制miR-877表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.4TRIM72過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，LPS組的TRIM72蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6顯著增多(P<0.05)；與LPS+pcDNA組相比，LPS+pcDNA-TRIM72組的TRIM72表達(dá)量升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)量升高(P<0.05)，Bax表達(dá)量下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6含量顯著降低(P<0.05)。見圖3和表4，說明LPS可抑制心肌細(xì)胞H9c2中TRIM72的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，過表達(dá)TRIM72可減輕LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥，降低炎癥因子的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡。

圖3 TRIM72和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 TRIM72過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響

2.5miR-877靶向調(diào)控TRIM72的表達(dá) 通過Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TRIM72的3′UTR序列中含有與miR-877互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如表5所示，與miR-NC組相比，miR-877組野生型WT-TRIM72的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.05)；而突變型MUT-TRIM72的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性沒有明顯變化。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖4B和表6)，與miR-NC組(0.62±0.06)相比，miR-877組的TRIM72表達(dá)量顯著降低(0.29±0.03,P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.59±0.05)相比，anti-miR-877組的TRIM72表達(dá)量顯著升高(0.93±0.09，P<0.05),說明miR-877靶向負(fù)調(diào)控TRIM72的表達(dá)。

A：TRIM72的3′UTR中含有與miR-877互補(bǔ)的核苷酸序列；B:TRIM72蛋白表達(dá)；1～4：miR-NC組、miR-877組、anti-miR-NC組、anti-miR-877組

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6抑制TRIM72表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-877表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC組相比，LPS+anti-miR-877組的TRIM72蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6顯著降低(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bax表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)；與LPS+anti-miR-877+si-NC組相比，LPS+anti-miR-877+si-TRIM72組的TRIM72蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，炎癥因子TNF-α和IL-6含量顯著增多(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Bax表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。見表6和圖5。說明抑制TRIM72表達(dá)可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-877對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用。

表6 抑制TRIM72表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-877表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-877組、anti-miR-877+si-NC組、anti-miR-877+si-NC-TRIM72組

3 討 論

心肌炎最常見的原因是病毒感染，VMC是年輕人(<40歲)猝死的重要原因，也是擴(kuò)張型心肌病的潛在原因〔11〕。目前尚無有效的治療策略，臨床通常用特異性抗病毒或免疫抑制藥物治療感染改善心臟功能，但是該疾病某些免疫致病形式對(duì)免疫抑制藥物(如環(huán)孢菌素A和環(huán)磷酰胺)的抵抗也導(dǎo)致治療失效〔12〕。研究心肌炎發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)于開發(fā)有效的治療至關(guān)重要。

miRNA在VMC中主要參與蛋白結(jié)合、小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、GO蛋白磷酸化，在cAMP信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、ras信號(hào)通路、rap1信號(hào)通路、erbb信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路中出現(xiàn)異常表達(dá)〔13〕。關(guān)于miR-877，以往的研究多集中在癌癥和肺纖維化等，其與細(xì)胞增殖和纖維化有關(guān)〔14～16〕。Yoon等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-877 在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥大鼠心肌中表達(dá)上調(diào)，與內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷有關(guān)。申陽等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-877在大鼠糖尿病心肌病(DCM)中表達(dá)異常，可能是預(yù)測(cè)糖尿病早期心血管并發(fā)癥的標(biāo)志物。因此，本研究認(rèn)為miR-877在心肌細(xì)胞炎癥中可能具有重要作用。本研究結(jié)果與Yoon等〔17〕研究結(jié)果一致，抑制miR-877表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥，降低炎癥因子的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了miR-877在LPS誘導(dǎo)的心肌炎癥中發(fā)揮重要作用。

TRIM72是TRIM家族蛋白之一，最初發(fā)現(xiàn)于骨骼肌細(xì)胞，也叫MG53，在骨骼肌和心肌中特異表達(dá)，參與肌細(xì)胞損傷后膜修復(fù)過程和抵抗心臟缺血/再灌注損傷等〔19〕。TRIM72蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化炎癥具有保護(hù)作用〔20〕，給予小鼠心臟或新生小鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注或組織缺氧/氧化應(yīng)激炎癥，均可明顯抑制TRIM72的表達(dá)〔21〕。TRIM72對(duì)心肌損傷后的膜修復(fù)和傷口愈合至關(guān)重要〔22〕，重組人TRIM72蛋白對(duì)化學(xué)、機(jī)械或紫外線誘導(dǎo)的肌肉和非肌肉細(xì)胞損傷提供劑量依賴性保護(hù)〔23〕。本研究結(jié)果再次驗(yàn)證了TRIM72在心肌炎癥中具有修復(fù)作用。此外，本研究結(jié)果提示miR-877與TRIM72可能存在調(diào)控關(guān)系。