miR-9-5p通過靶基因ADAMTS18調控肺癌細胞增殖、遷移、侵襲的分子機制

徐漢橋 潘捷 田學濤 陳志強 張玉萍

(1江漢大學附屬醫院武漢市六醫院胸外科，湖北 武漢 430015；2華中科技大學協和江南醫院武漢市江夏區第一人民醫院消化科)

肺癌是世界第一大癌癥，隨著每年發病率的上升，死亡率高居惡性腫瘤首位，且女性患者數量也呈逐年上升趨勢〔1～4〕。研究肺癌發生和發展的分子生物學機制，為肺癌的分子診斷和治療提供新的靶點已成為其基礎研究的熱點。大量研究表明，在肺癌中miRNA通過調控下游基因控制癌細胞的增殖、遷移和侵襲及耐藥性等〔5～7〕。miR-9-5p是一種高度保守的微小RNA，主要表達于中樞神經系統〔8〕，并調節其正常發育。miR-9-5p在宮頸癌、舌癌、乳腺癌中表達異常，與癌細胞的增殖、轉移、侵襲有關〔9～11〕。miR-9-5p在非小細胞肺癌患者血清中表達上調，是肺癌診斷的潛在標志物〔12〕。金屬蛋白酶ADAMTS18〔13〕在多種腫瘤組織中表達異常，如食管鱗狀細胞癌、宮頸癌癌、乳腺癌、腎透明細胞癌等〔14～18〕。ADAMTS18在肺癌組織中通常呈現甲基化，過表達ADAMTS18可抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲〔19〕。miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌增殖、遷移和侵襲中都具有重要作用，而兩者在肺癌中的關系尚不清楚。本課題擬研究 miR-9-5p影響A549細胞增殖、侵襲和遷移的分子機制及ADAMTS18在此機制中的作用，以期為肺癌的分子治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞株A549和人正常支氣管上皮細胞株HBE購自ATCC；胎牛血清(FBS)和DMEM培養基購自Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亞砜(DMSO)和四氮唑藍(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、Total RNA提取試劑盒、real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；抗ADAMTS18抗體和GAPDH抗體購自Abcam；顯微鏡、酶標儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自Thermo。

1.2細胞培養 用含10% FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM培養基培養A549細胞，培養條件：37℃ 5% CO2培養箱中培養，濕度95%。培養細胞至對數生長期，消化傳代。

1.3細胞轉染 將對數生長期A549稀釋至(1～2)×106個細胞/ml，200 μl細胞/孔接種于6孔板中，細胞培養至融合度為80%～90%時進行轉染。先用無血清OptiMEM培養液稀釋脂質體、miR-NC、miR-9-5p、anti-miR-NC、anti-miR-9-5p、pcDNA、pcDNA-ADAMTS18、anti-miR-9-5p+si-NC、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18、WT-ADAMTS18+miR-NC、WT-ADAMTS18+miR-9-5p、MUT-ADAMTS18+miR-NC和MUT-ADAMTS18+miR-9-5p的載體，之后取等體積脂質體和各組載體混合，室溫孵育20 min，將混合液滴入到培養好的細胞孔板中，輕柔混勻，培養6 h，換成完全培養基，轉染48 h后收集細胞。

1.4Real-time PCR檢測mRNA表達 收集支氣管上皮細胞和轉染48 h的各組A549細胞(anti-miR-NC、anti-miR-9-5p組)，提取總RNA，保存于-80℃。然后按照反轉錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應程序為16℃ 30 min、42℃ 30 min、72℃ 10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA測定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR的說明書進行反應，反應程序為：95℃ 6 min；95℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s，40個循環；72℃ 10 min。引 物 如 下：miR-9-5p 上 游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游：5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3′；ADAMTS18上游：5′-TGCACAACGGCAGGAAAAAG-3′，下游：5′-TCAAAATCGCCGAGGGCTTA-3′。運用Bio-Rad PCR系統進行數據分析。

1.5MTT實驗測定細胞活性 A549細胞轉染48 h后，收集細胞，Trypsin消化細胞，調整細胞濃度至1×104個/ml，200 μl/孔接種于96微孔板中，繼續培養，分別在24、48、72 h進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μl(5 mg/ml)MTT，培養4 h，棄上清培養液，再在每孔加入150 μl DMSO，室溫混勻5 min，酶標儀測定OD 490 nm 吸光度(A)值。

1.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：轉染后的各組A549細胞(anti-miR-NC組、anti-miR-9-5p組、pcDNA組、pcDNA-ADAMTS18組、anti-miR-9-5p+si-NC組、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18組)培養至對數生長期，收集細胞，加入含10 g/L BSA的無血清DMEM培養基，稀釋細胞濃度為2×105個/ml。Transwell下層培養孔加入500 μl 10%FBS培養基作為遷移趨化物，Transwell上層小室中加入100 μl細胞，將上層小室放入下層培養孔中，培養48 h，用棉簽拭去基質膠和上層小室的細胞，冰甲醛固定細胞，染色，顯微鏡觀察計數。侵襲實驗：以4℃無血清培養基1∶5比例稀釋Matrigel，加入上層Transwell小室，烘干，以下步驟同遷移實驗，上層小室加入100 μl細胞，下層加入500 μl 10%FBS培養基，培養48 h，固定細胞，染色，計數。

1.7雙熒光素酶報告實驗 A549細胞轉染48 h，收集細胞，Trypsin消化，計數，以1×104個細胞/孔接種于24孔板中，繼續培養24 h，觀察若細胞融合度達到80%～90%，進行轉染，分別構建ADAMTS18的野生型(WT-ADAMTS18)和突變型(MUT-ADAMTS18)雙熒光素酶報告載體，分別共轉染miR-NC或miR-9-5p，轉染后培養48 h，收集細胞，用裂解緩沖液室溫裂解20 min，離心收集上清，-20℃保存或直接加入熒光素酶底物，發光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.8Western印跡實驗 將HBE細胞和轉染48 h后的各組A549細胞用RIPA裂解液裂解，冰浴超聲破碎細胞，收集蛋白并檢測濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，室溫封閉1 h，加入一抗ADAMTS18(1∶1 000)，4℃孵育過夜。洗膜2次，然后加入的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。以GAPDH為內參照，分析蛋白水平。

1.9統計學處理 采用 SPSS21.0統計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌A549細胞和人正常支氣管上皮細胞HBE中的表達 Western印跡和qRT-PCR結果表明，與人正常支氣管上皮細胞HBE相比，在肺癌細胞A549組中ADAMTS18的mRNA和蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，而miR-9-5p表達量顯著上升(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 檢測ADAMTS18在肺癌A549細胞和人正常支氣管上皮細胞HBE中的表達

表1 檢測miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌A549和支氣管上皮細胞HBE中的表達

2.2抑制miR-9-5p可抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲 qRT-PCR結果表明，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-9-5p組miR-9-5p表達量顯著下降(P<0.05)。MTT實驗結果表明，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-9-5p組的細胞活性(OD490 nm)在作用48、72 h顯著下降(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-9-5p組A549遷移細胞數和侵襲細胞數顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 抑制miR-9-5p對肺癌A549細胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.3miR-9-5p靶向調控ADAMTS18的表達 Targetscan軟件預測結果顯示，ADAMTS18的3′-UTR序列中含有與miR-9-5p互補的核苷酸序列，見圖2。雙熒光素酶報告系統結果顯示，與miR-NC組相比，miR-9-5p組野生型WT-ADAMTS18的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而突變型MUT-ADAMTS18的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化(P>0.05)。Western印跡結果表明，與miR-NC組(0.42±0.04)相比，miR-9-5p組ADAMTS18蛋白表達量(0.19±0.03)顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.37±0.04)相比，anti-miR-9-5p組ADAMTS18蛋白表達量(0.84±0.08)顯著上升(P<0.05)，見表3和圖3。

圖2 ADAMTS18的3’UTR中含有與miR-9-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖3 ADAMTS18蛋白表達

2.4ADAMTS18過表達抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲 Western印跡結果發現，與pcDNA組相比，pcDNA-ADAMTS18組ADAMTS18蛋白表達顯著下降，見圖4。qRT-PCR結果發現，與pcDNA組相比，pcDNA-ADAMTS18組ADAMTS18 mRNA表達顯著上升(P<0.05)。MTT實驗和Transwell實驗結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-ADAMTS18組A549細胞活性在作用48、72 h顯著降低(P<0.05)，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著下降(P<0.05)，見表4。

圖4 檢測肺癌A549細胞中ADAMTS18蛋白的表達

表4 過表達ADAMTS18對肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5抑制ADAMTS18表達逆轉了抑制miR-9-5p對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響 Western印跡結果發現，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-9-5p組ADAMTS18蛋白表達顯著上升(P<0.05)，與anti-miR-9-5p+si-NC組相比，anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18組ADAMTS18蛋白表達顯著下降(P<0.05)。MTT和Transwell結果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-9-5p組A549細胞活性在作用48 h和72 h顯著下降(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-9-5p+si-NC組相比，an-ti-miR-9-5p+si-ADAMTS18組A549細胞活性在作用48 h和72 h時顯著上升(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著上升(P<0.05)。見表5,圖5。

表5 抑制ADAMTS18表達逆轉了抑制miR-9-5p對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的作用

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-9-5p組、anti-miR-9-5p+si-NC組、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18組

3 討 論

隨著環境污染的加劇，吸煙人口的低齡化，2015年我國的肺癌新發病例數約55.8萬例，且死亡病例數約49.5萬例，肺癌發病率逐年上升，患者5年生存率極低〔1～4〕。研究肺癌發生、轉移機制，對肺癌診斷和治療具有指導意義。

研究表明，miRNA參與肺癌發生和發展全過程，并與肺癌的預后和耐藥性有關〔5～7〕。作為一種高度保守的miRNA，miR-9-5p最早發現于神經系統，調控神經系統正常發育，近年來發現其在多種癌癥中異常表達，且與癌癥的發展有關〔8〕。Xie等〔9〕發現，在宮頸癌中，miR-9-5p是lncRNA NEAT1的靶向結合位點，與癌細胞的增殖遷移有關。陳偉泉等〔10〕研究表明，miR-9-5p在舌癌組織中表達量顯著上調，通過靶向抑制Ambral表達進而促進舌癌細胞增殖。Barbano等〔11〕發現，在乳腺癌中，miR-9-5p表達上調，與癌細胞的轉移、侵襲和患者不良預后有關，miR-9-5p的上調是表觀遺傳機制和雌性激素調節途徑之間相互作用的結果。Yang等〔12〕研究發現，在中國云南宣威市，miR-9-5p在非小細胞肺癌患者血清中表達上調，是非小細胞肺癌診斷的潛在標志物。本研究結果表明，與人正常支氣管上皮細胞HBE相比，miR-9-5p在肺癌A549細胞中顯著上調，與Yang等〔12〕的研究結果一致，而抑制miR-9-5p表達可抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲，證實了miR-9-5p在癌癥發展中的作用。

ADAMTS18是含血小板結合蛋白基序的解聚素金屬蛋白酶的一種，與腫瘤的血管生成和侵襲性密切相關，在多種腫瘤組織中表達異常〔13,15,20,21〕。郭麗麗等〔14〕發現，在食管鱗狀細胞癌中，ADAMTS18表達量顯著低于癌旁組織，與腫瘤的發生和分化程度有關。

在宮頸癌中，ADAMTS18表達下調〔16〕。Xu等〔17〕研究表明，ADAMTS18在腎透明細胞癌中表達下調，且呈高甲基化。Xu等〔18〕發現，ADAMTS18在乳腺癌中表達下調，過表達ADAMTS18可抑制癌細胞遷移和侵襲。Zhang等〔19〕發現，ADAMTS18在肺癌組織中通常呈現甲基化，過表達ADAMTS18可抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲，ADAMTS18通過抑制EGFR/AKT信號傳導，增強肺癌細胞對順鉑的敏感性。本研究證實，ADAMTS18在肺癌A549細胞中的表達量顯著下降，過表達ADAMTS18可抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲。

此外，Targetscan軟件預測結果暗示miR-9-5p與ADAMTS18之間可能存在結合位點或調控關系。通過Western印跡和雙熒光素酶報告系統結果發現，miR-9-5p靶向負調控ADAMTS18的表達，抑制ADAMTS18逆轉了下調miR-9-5p對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。本研究證實了在非小細胞肺癌中miR-9-5p和ADAMTS18之間的調控關系。

本研究首次闡述了miR-9-5p在非小細胞肺癌A549細胞中靶向負調控ADAMTS18的表達，進而抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲。miR-9-5p有望成為非小細胞肺癌診斷和治療的分子生物學靶點，對肺癌的診斷和治療提供了新的研究方向。