Shh在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及對腎小管上皮細胞凋亡的影響

戴黎 周祖蓮 姜安雅

(重慶市黔江中心醫院腎內科，重慶 409000)

糖尿病腎病早期發病無任何癥狀，且病程進展較慢。引發糖尿病腎病的主要因素與微血管發生病變、糖代謝紊亂及生長因子失衡相關，從而造成糖尿病合并腎小球硬化的發生〔1，2〕。研究糖尿病腎病的發病機制是目前研究的熱點。音猥因子(Shh)參與多種組織器官的發育，廣泛存在于哺乳動物體內〔3〕。研究發現，在糖尿病腎病中Shh基因表達可降低腎小管上皮細胞凋亡，Shh可直接參與細胞分化，起到了調控和降低誘導細胞凋亡的作用〔4〕。Shh基因表達在糖尿病腎病組織中經RNA干擾后可起到降低基因表法的作用。本研究擬探討糖尿病腎病患者腎組織中Shh的表達水平及其對腎小管上皮細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 2016年5月至2018年10月經腎活檢確診為2型糖尿病腎病的患者28例為對照組，其中男15例，女13例，年齡32～68歲，平均(54.2±5.4)歲；納入并提取的腎組織標本均符合世界衛生組織的診斷標準。同期納入已行腎癌切除的患者15例為實驗組，其中男10例，女5例，年齡47～81歲，平均(55.3±2.6)歲；同期病理診斷確診為無腎癌表達者16例為正常組，男7例，女9例，年齡47～63歲，平均(50±2.7)歲。人腎小管上皮細胞HK-2 ATCC均購自上海名勁生物科技有限公司。

1.2主要儀器及試劑 采用Proteintech公司的辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化(p)-JNK、兔抗人單克隆抗體B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)等標記物；上樣緩沖液、蛋白抽提試劑、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、lipofectamine2000均購自美國Milipore公司；Annexin-V細胞凋亡檢測試劑盒與碘化丙錠(PI)均采用上海翊圣生物科技有限公司；采用Sigma公司提供的胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM培養基；流式細胞儀與CO2培養箱均由THermo公司提供。

1.3Western 印跡檢測組織中Shh表達水平 將采集后的組織使用醫用剪，剪碎加入苯甲基磺酰氟化物(PMSF)進行預冷并提取蛋白試劑(每250 mg組織中加入1 ml)，搖勻后取裂解液，4℃ r/min離心20 min，蛋白上清液轉移至EP管中，蛋白濃度采用二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒進行提取檢測，蛋白樣品根據3∶1比例進行混合，放入煮沸水中變性后加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中進行電壓電泳分析蛋白表達。

1.4細胞培養 將冷凍的腎小管上皮細胞取出進行融化，放置離心管中并加入5.8 mmol/L葡萄糖進行培養，1 000 r/min離心10 min后加入10%胎牛血清培養低糖細胞，培養結束放入37℃培養箱中；當細胞融合度達到90%時棄細胞液，并加入0.25%胰蛋白酶進行離心。細胞轉染：取腎小管上皮細胞，以每孔2×105接種到細胞培養板中培養過夜，將Shh空核表達載體與不含血清的培養基混合靜置5 min，將脂質體2000轉染試劑與不含血清培養基混合，兩種液體加入細胞中培養6 h，更換為低糖血清進行培養，轉染后48 h，檢測細胞中Shh表達水平。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 培養至48 h取出，消化后，1 000 r/min，離心10 min，棄酶消化液加入細胞培養液，并將細胞濃度調整至106個/ml細胞以1 000 r/min離心10 min，離心結束后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗并加入結合緩沖液200 μl 重懸細胞，常溫下反應30 min后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6JNK抑制劑對腎小管上皮細胞凋亡的檢查 JNK信號通路抑制劑SP600125，劑量為20 μmol/L，應用在腎小管上皮細胞中48 h，采用流式細胞儀檢測凋亡情況；取對照組和實驗組腎組織細胞并培養48 h后提取細胞中Bcl-2蛋白、JNK及p-JNK，采用Western 印跡法檢測，檢測方法同1.3。

1.7統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1Shh基因在腎組織中的表達 實驗組Shh表達水平(0.87±0.07)明顯高于對照組和正常組(0.43±0.07、0.44±0.08，P<0.05)，但正常組Shh水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測3組Shh表達水平

2.2細胞凋亡檢測結果 實驗組腎小管上皮細胞凋亡率顯著高于正常組(P<0.01)。對照組Bcl-2、Bax蛋白水平顯著低于實驗組和正常組(P<0.01)。見表1，圖2。

圖2 Shh對腎小管上皮細胞凋亡相關蛋白的影響

表1 3組腎小管上皮細胞凋亡及相關蛋白表達比較

2.3細胞中JNK、p-JNK表達結果 細胞轉染后3組腎小管上皮細胞中的JNK表達差異無統計學意義(P>0.05)，但正常組和實驗組p-JNK表達明顯高于對照組(P<0.01)。見圖3，表2。

圖3 Shh對腎小管上皮細胞JNK、p-JNK表達的影響

表2 3組腎小管上皮細胞JNK、p-JNK表達比較

2.4JNK抑制劑對細胞凋亡的影響 對照組與實驗組腎小管上皮細胞中JNK的水平差異無統計學意義(P>0.05)。但對照組凋亡率、p-JNK明顯高于實驗組(均P<0.01)。見表3，圖4。

表3 兩組腎小管上皮細胞的凋亡情況比較

圖4 腎小管上皮細胞在JNK作用細胞相關蛋白表達及凋亡的影響

3 討 論

Shh基因最早發現于果蠅中，參與果蠅的眼、腦及翅膀的發育形成，隨后研究發現，Shh基因在胚胎發育過程中發揮關鍵信號因子的作用〔5，6〕。人Shh基因屬于染色體7q36且與背腹軸神經管的形成、消化道及頭面部等發育存在密切關聯。研究表明，Shh基因具備調控甲狀腺畸形及腎臟等疾病，其病理過程對腫瘤形成也起到了相關調控〔7〕。Shh發生缺氧后會造成腎周圍細胞轉化為肌成纖維和引發腎小管上皮細胞凋亡。有研究顯示，腎小管上皮細胞凋亡的主要原因與高糖因素呈正相關，而通過干擾Shh基因可有效降低高糖，從而改善腎小管上皮細胞凋亡〔8〕。

近年來，糖尿病的發病率呈逐年上升的趨勢，已是全球面臨的重要公共健康問題。糖代謝影響因素也成為研究的熱點，各研究機構對血清尿酸和糖尿病及代謝因子的關系持有不同的意見〔9〕。近期有研究〔10〕表明糖代謝與Shh基因有一定關系，但因醫療技術的局限性，這種說法還備受爭議。美國大樣本研究〔11〕指出Shh基因水平與糖尿病的發生是呈負相關的，與此同時，有數據顯示Shh基因的水平與胰島素的分泌呈正相關〔12〕。糖尿病患者比正常人群具有更高的Shh基因水平低。Shh基因濃度過高與糖尿病的血管病有關，若妊娠期孕婦Shh基因水平過高，可能導致出現妊娠糖尿病。心肌細胞與腫瘤細胞等相關細胞的凋亡過程中，JNK及MAPK蛋白均參與了其中，JNK屬于MAPK家族的成員之一，但JNK信號通路是否可促進細胞或抑制細胞凋亡的研究尚未有實驗表明。有實驗表明，高糖促進了小鼠腎小管上皮細胞凋亡，在凋亡過程中發現JNK表達明顯升高〔13〕。有研究顯示，高糖導致的腎小管上皮細胞凋亡采用西格列汀后可有效抑制JNK信號的表達，西格列汀屬于DPP-4抑制劑是治療2型糖尿病的主要藥物，此藥物安全性高且服藥后患者因體重造成的不良反應率明顯降低〔14，15〕。本研究表明，JNK信號通路抑制后腎小管上皮細胞凋亡明顯降低，提示Shh抑制JNK信號通路可降低高糖誘導腎小管上皮細胞的凋亡。

綜上，通過Shh抑制高糖對腎小管上皮細胞的誘導，其主要作用機制與JNK相關，且糖尿病腎病患者腎組織中的Shh明顯下調。