肺腺癌組織FGL1表達及其對肺腺癌放射敏感性的影響

劉嘉慶 龍煥屏 于洋洋 李光

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放療科，遼寧 沈陽 110001)

肺腺癌通常表現(xiàn)出不同程度的放射抵抗性，導致其放射治療效果欠佳〔1～3〕。如何提高肺腺癌的放射敏感性是目前放療領(lǐng)域急需解決的問題。纖維蛋白原樣蛋白(FGL)1是主要在肝臟中衍生表達的一類生長因子。研究表明，F(xiàn)GL1在非小細胞肺癌(NSCLC)中表達上調(diào)，被認為具有一定的致癌效應(yīng)〔4〕。FGL1與NSCLC免疫治療的預后有關(guān)，其表達水平可預測程序性細胞死亡(PD)-1/配體(L)1抑制劑療效〔4〕。FGL1可影響細胞周期，而細胞周期與細胞內(nèi)在的放射敏感性密切相關(guān)〔5〕。有關(guān)FGL1在肺腺癌中的表達及作用的研究并不多，F(xiàn)GL1對放療的影響目前尚未見報道。本文擬分析FGL1表達及其可能對肺腺癌的放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 A549細胞購自沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司；質(zhì)粒購自吉凱基因；FGL1引物、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Takara逆轉(zhuǎn)錄和實時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司；NEOFECTTMDNA轉(zhuǎn)染試劑購自北京碼因科技有限公司。

1.2人肺腺癌組織樣本的選擇 選取在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科手術(shù)的肺腺癌患者的24例癌和癌旁組織標本。男10例，女14例，年齡48～69歲，平均(57.12±3.24)歲。

1.3人肺腺癌細胞系的培養(yǎng) 配置含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，將A549細胞置于含有5% CO2的37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4轉(zhuǎn)染 按照說明書要求，利用助轉(zhuǎn)染試劑將FGL1沉默(shRNA#1/#2)及沉默對照(NC-shRNA)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細胞中。

1.5RT-PCR FGL1正向引物5′-CTTTTGCAGGAGAATGAAGTCC-3′，反向引物5′-CTCTGAACAATCTGCATACTGC-3′；β-actin正向引物5′-CCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3′，反向引物5′-ATGTTGCCCTAGACTTCGAGCAAG-3′。使用2-ΔΔCt方法計算倍數(shù)變化。

1.6克隆形成實驗 在6孔板中根據(jù)劑量梯度接種不同數(shù)目的細胞，過夜培養(yǎng)后分別給予0，2，4，6，8 Gy的電離輻射；繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色；計數(shù)克隆，根據(jù)單擊多靶模型繪制劑量-存活曲線。

1.7統(tǒng)計學分析 利用GraphPad Prism7.00進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FGL1在肺腺癌及癌旁組織中的表達差異 16例肺腺癌組織FGL1含量比癌旁組織高；肺腺癌FGL1含量(11.100±19.333)明顯高于癌旁組織(1.000±0.000，P<0.05)。

2.2A549細胞中FGL1沉默效果 轉(zhuǎn)染shRNA#1和shRNA#2的A549細胞中FGL1含量分別為0.524±0.154和0.494±0.072，顯著低于轉(zhuǎn)染NC-shRNA的A549細胞(1.000±0.000；P<0.01和P<0.001)。

2.3沉默F(xiàn)GL1對肺腺癌細胞放射敏感性的影響 克隆形成實驗獲得的克隆和A549細胞劑量-存活曲線見圖1，轉(zhuǎn)染shRNA#1和shRNA#2的A549細胞平均致死劑量(D0)、準閾劑量(Dq)、離體腫瘤培養(yǎng)細胞經(jīng)過2 Gy照射后細胞存活分數(shù)(SF2)均顯著低于轉(zhuǎn)染NC-shRNA的A549細胞(P<0.05)；轉(zhuǎn)染shRNA#1和shRNA#2的A549細胞的放射增敏比(SER)均大于1。見表1。

圖1 克隆形成實驗檢測沉默F(xiàn)GL1對A549細胞放射敏感性的影響

表1 A549細胞劑量-存活曲線參數(shù)

3 討 論

放療聯(lián)合靶向、免疫、化療等方式可顯著改善晚期NSCLC患者的預后，并具有增敏免疫療效的作用〔6,7〕。據(jù)統(tǒng)計，約有64%的NSCLC患者在治療的不同時期接受過放療〔8〕。放療主要通過電離輻射誘導DNA雙鏈斷裂并抑制DNA修復，有效殺傷或殺滅腫瘤細胞，降低患者的腫瘤負荷，其療效主要取決于腫瘤細胞的放射敏感性〔9〕。然而，隨著放療在NSCLC治療中的普及，出現(xiàn)了不少對放療不敏感的現(xiàn)象，這種放療抵抗在肺腺癌中尤為明顯，導致其放療效果欠佳〔1～3,10〕。目前對NSCLC放療抵抗的研究多集中在細胞周期阻滯與DNA修復、DNA損傷修復基因表達、腫瘤微環(huán)境的影響等方面〔11,12〕。

在某些腫瘤中，F(xiàn)GL1的表達變化可以改變細胞周期〔5〕。在胃癌的研究中，F(xiàn)GL1與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)，但不同瘤種中FGL1的表達和作用可能存在差異〔13,14〕。

本文結(jié)果顯示，F(xiàn)GL1在肺腺癌中的表達顯著高于癌旁組織，與Wang等〔4〕研究結(jié)果相一致，驗證了FGL1在NSCLC中表達上調(diào)。通過癌癥基因組圖譜(TCGA)的進一步在線分析也提示FGL1在其他腫瘤，包括乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和結(jié)直腸癌中均有高表達，提示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的普遍作用〔4〕。D0越小，腫瘤細胞的放射敏感性越高；Dq體現(xiàn)了腫瘤細胞積累亞致死性損傷的能力，等同于克服劑量存活曲線肩區(qū)所需要的劑量；SF2能夠反映腫瘤細胞的放射敏感性；SER是沉默對照與沉默組腫瘤細胞的D0之比，SER大于1表示沉默組相較于沉默對照組起到了放射增敏的效果。本結(jié)果表明沉默F(xiàn)GL1可以顯著降低A549細胞對輻射的抵抗力。

綜上，F(xiàn)GL1在肺腺癌組織中表達上調(diào)，沉默F(xiàn)GL1可以增加肺腺癌的放射敏感性。FGL1有可能成為肺腺癌患者放射治療的新靶標。