杜仲葉提取物對人牙周膜干細胞體外增殖及成骨分化的影響

劉焱 陳青宇， 許鳳 王忠厚 高翔 高俊武

(包頭醫學院 1口腔學院，內蒙古 包頭 014060；2第一附屬醫院口腔科)

隨著中國逐漸進入老齡化社會，老年口腔疾病的患病率呈上升趨勢。牙周炎是老年人群中多見、發病率高、全世界范圍內廣泛流行的慢性病之一，已成為成人牙齒喪失的主要原因〔1〕。牙周炎是炎癥破壞性疾病，會導致牙周韌帶、牙骨質、牙槽骨等牙齒支持組織破壞吸收。有研究證實，牙周炎不但會對口腔系統組織結構和功能造成損傷，同時還是多種全身疾病的誘因〔2〕，例如冠心病、高血壓、慢性呼吸系統疾病、胃炎及糖尿病等。在控制感染的基礎上重建牙周組織是牙周炎治療的最終目標。牙周組織工程研究的不斷深入，給牙周組織再生帶來新的機遇和挑戰〔3〕。人牙周膜干細胞(hPDLSCs)是由人牙周膜分離出的間充質來源的多能干細胞，具有高增殖能力、自我更新能力和多向分化潛能〔4〕。通過誘導分化，hPDLSCs 可形成牙槽骨、牙周膜-牙骨質復合體的結構，從而實現真正意義上的牙周組織再生〔5〕。成骨潛能在牙周組織修復過程中發揮重要作用。中藥杜仲為我國特有杜仲科植物。臨床上常配伍他藥用于治療骨質疏松、骨性關節炎、骨折等疾病。現代藥理學研究證實杜仲的有效化學成分具有調節骨代謝、加速成骨、促進骨形成等作用〔6〕。但杜仲對hPDLSCs體外擴增效率和生物學特性的影響尚不清楚，本實驗旨在研究杜仲葉提取物對體外培養的hPDLSCs增殖與成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 健康年輕恒牙，取自16～18周歲患者的正畸拔牙的前磨牙樣本，由包頭醫學院第一附屬醫院口腔科提供；DMEM培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；青、鏈霉素(華北制藥)；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 值7.2～7.4)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA,Hyclon，美國)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸(Sigma，美國)；小鼠抗人波形絲蛋白(Dako，美國)、羊抗小鼠 IgG-TRITC 熒光二抗(Sigma，美國)、熒光染料Hoechst33258(Sigma，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國)、二甲基亞砜(DMSO，Amresco，美國)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(AAT，美國)；Trizol、氯仿、異丙醇、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM，Takara，日本)。二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國)；離心機(Kubota2100，日本)；倒置相差顯微鏡及照相系統(Olympas，日本)；熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，日本)；酶標儀(SpectraMax M2，Molecular Devices，美國)；熒光實時定量PCR儀(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亞)。

1.2杜仲葉提取物的配制 將新鮮杜仲葉于60℃條件下干燥后細磨成粉，取1 g加入10 ml甲醇，室溫震蕩1 h，靜置過夜，15 000 r/min離心10 min，棄沉淀，收集上清、真空濃縮，加水至10 ml溶解剩余物即得杜仲葉提取物原液。原液經0.22 μm膜過濾，以DMEM培養基稀釋，分別配制成含杜仲葉提取物10-4，10-5，10-6g/ml的不同質量濃度的工作液待用。

1.3人牙周膜干細胞分離培養

1.3.1標本納入標準 16～18周歲正畸拔牙的前磨牙。拔除的年輕恒牙無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周病變，無牙周及黏膜疾患，同時可刮取到所需牙周膜組織，且所有納入個體無系統疾病?；颊咧橥獠⒑炇鹬橥鈺?/p>

1.3.2酶解組織塊法原代培養、分離純化hPDLSCs 牙拔除前以75%乙醇充分消毒牙體周圍組織，拔除后立即放入預冷含高倍雙抗DMEM培養基中保存備用，低溫保存狀態下送實驗室，2 h內原代取材。在超凈臺內用PBS沖洗牙根部3～5次，刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，修剪組織塊為約1 mm3，用2 mg/ml的Ⅰ型膠原酶在37℃下消化1 h，離心棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基均勻所得沉淀，平鋪于培養瓶底部，置37℃、5%CO2孵箱中培養，2 d后更換培養基并棄去未貼壁細胞，隔3 d換液1次。細胞生長達80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.4免疫熒光染色鑒定細胞來源 取P4代hPDLSCs消化制成單細胞懸液，制備細胞爬片，使用免疫熒光染色方法進行波形絲蛋白(vimitin)鑒定，其中一抗為小鼠抗人vimitin。PBS漂洗細胞爬片，預冷的4%多聚甲醛固定30 min，1%牛血清白蛋白封閉30 min，加入抗vimitin一抗置于濕盒中過夜。次日PBS沖洗3次，避光條件下加入TRITC熒光標記二抗孵育1 h，PBS沖洗3次后用Hoechst33258復染核5 min，甘油封片、標記，于熒光顯微鏡下觀察細胞表面標記物vimitin的表達情況。

1.5實驗分組 實驗分為5組：空白對照組，含10%胎牛血清的DMEM培養基；陽性對照組，即為傳統成骨誘導劑組，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中加入10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸；3個實驗組，在傳統誘導劑組基礎上分別加入質量濃度為10-4，10-5，10-6g/ml杜仲葉提取物。

1.6細胞增殖能力檢測 取生長良好P4代hPDLSCs胰酶消化，細胞計數后，將密度調整為2×104/cm2接種于96孔板中，每孔100 μl，培養24 h。后棄上清，分別按照各實驗設計組更換培養條件，繼續培養1、3、5、7 d，每組設3個重復孔。培養結束后，每孔加20 μl MTT溶液，37℃、5%CO2培養箱內孵育4 h，棄上清、向每孔加150 μl DMSO，振蕩10～15 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定各孔吸光光度值(OD值)。

1.7ALP活性測定 將P4代hPDLSCs消化、計數，調整密度為2×104/cm2接種于96孔板中，每孔100 μl，培養24 h。棄上清，分別按照5個實驗設計組更換培養條件，繼續分別培養3、5、7 d，每組設3個重復孔。按ALP試劑盒上所示的步驟進行檢測，用酶聯免疫檢測儀在520 nm波長處測定各孔OD值。

1.8RT-PCR 分別按照5個實驗設計組培養hPDLSCs細胞2 w后，采用Trizol法提取各實驗設計組的細胞總RNA，用Nano Drop儀器對所提取的RNA進行質檢。用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA(以β-actin為內參，逆轉錄Runx2、OPN和OCN目的基因)50℃ 60 min，85℃ 5 min，16℃ 10 min，合成cDNA第一鏈。之后利用Nano Drop儀器測定濃度，將其配平到50 mg/L，作為模板待用。按每孔20 μl體系加入96孔板，每組重復3次，進行RT-PCR擴增。擴增條件為：95℃10 min；95℃ 15 s，60～64℃ 30 s，72℃ 30 s，循環25～32次；72℃延伸7 min。擴增引物序列及反應體系：RUNX-2：上游：5′TGGTTACTGTCATGGCGGGTA3′、下游：5′TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA3′,長度101 bp；OPN:上游：5′CTCCATTGACTCGAACGACTC3′、下游5′CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGAT，長度230 bp；OCN：5′CACTCCTCGCCCTATTGGC3′、下游5′CCCTCCTGCTTGGACACAAAG3′，長度112 bp。

1.9統計分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1原代培養hPDLSCs的形態學觀察 hPDLSCs原代培養7 d可見，細胞形態為長梭形或多邊形，貼壁生長，較分散。14 d后，細胞增多，逐漸融合，呈放射狀、旋渦狀排列，胞體豐滿，胞質均勻。培養21 d 后，細胞長至80%匯合，細胞形態均一，呈長梭形，核圓形或卵圓。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養的hPDLSCs(×100)

2.2免疫熒光染色鑒定hPDLSCs的來源 免疫熒光染色可見vimitin表達呈陽性，vimitin在胞質內表達呈紅染，而不在細胞核中表達；熒光染料Hoechst33258將細胞核染為藍色；兩者復合。見圖2。

圖2 免疫熒光法檢測hPDLSCs的Vimitin表達(×400)

2.3細胞增殖情況 細胞接種后，隨著培養時間的延長，5組細胞數量和細胞活性也逐漸增加。第1天時，OD值普遍較小，各組細胞之間增殖速度無顯著差異(P>0.05)。第3～5天，細胞增殖速度明顯加快，OD值持續增加，陽性對照組及3個實驗組的OD值均高于空白對照組(P<0.05，P<0.01)，同時3個實驗組的OD值均高于陽性對照組(均P<0.05)。到了第7天，5組細胞均達到最高的OD值，細胞的增殖量達到最高，3個實驗組的OD值均顯著高于陽性對照組、空白對照組(均P<0.01)。各實驗組中的OD值隨著杜仲濃度的增加而增加，存在劑量依賴效應。見表1。

表1 MTT檢測杜仲葉提取物對培養不同時間hPDLSCs增殖的影響

2.4ALP活性測定 hPDLSCs在陽性對照組和3個實驗組分別培養的3、5、7 d中ALP活性均明顯增高，在空白對照組則變化不顯著。與空白對照組相比，陽性對照組和3個實驗組ALP活性有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，3個實驗組與陽性對照組相比ALP活性的差異有統計學意義(P<0.05)。各實驗組分別含質量濃度為10-4，10-5，10-6g/ml 的杜仲葉提取物均對hPDLSCs的ALP活力有上調作用，其中以質量濃度為10-4g/ml的杜仲葉提取物實驗組的上調作用最明顯，且各實驗組上調的ALP活性具有時間依賴性，從第5天開始顯著升高，第7天ALP活力最高。見表2。

表2 杜仲葉提取物對培養不同時間 hPDLSCs的 ALP活性的影響

2.5RT-PCR檢測成骨相關基因的表達 在成骨誘導培養2 w后，對hPDLSCs成骨相關基因(Runx2，OPN，OCN)進行檢測后顯示，陽性對照組和各實驗組的成骨分化基因的表達均增加且顯著高于空白對照組(P<0.05,P<0.01)，各實驗組均明顯高于陽性對照組(均P<0.05)。濃度為10-4，10-5，10-5g/ml的杜仲葉提取物對hPDLSCs作用后，Runx2，OPN，OCN表達均上調。見表3。

表3 RT-PCR檢測成骨相關基因的表達

3 討 論

牙周炎能夠導致牙槽骨吸收及牙周組織損傷。由于人們通常對牙周炎的早期癥狀不夠重視，使得牙周組織長時間處于慢性感染狀態，這不但會引發和加重口腔系統疾病，同時還會影響全身健康。目前，我國60歲以上的老年人罹患牙周炎的概率高達 80%〔7〕。

牙周炎治療的關鍵是牙周組織及骨再生。目前，體外構建牙周膜模型的主要方法就是牙周膜的體外培養。2004年，美國國家健康研究院和牙科和顱面研究中心的Seo等〔4〕從人恒牙牙周膜組織中通過酶消化法分離出克隆形成細胞，并證實其具有向成牙骨質/成骨細胞樣細胞及脂肪細胞分化的能力，首次提出了hPDLSC的概念。hPDLSC具有較高的增殖及多向分化的潛能〔8〕，利用其進行體內和體外組織重建是使牙周組織修復再生的重要渠道。目前對PDLSC向牙周及成骨方向誘導，主要通過礦化誘導液、牙周細胞的條件培養及生長因子作用，缺乏特定有效的誘導微環境，因此尋找合適的誘導條件是牙周組織工程研究的重要方向。

很多中藥有效成分已被證實可以促進干細胞增殖和成骨分化。楊瑋等〔9〕研究發現小檗堿可促進大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化，增強骨鈣化。秦子順等〔10〕將中藥單體淫羊藿苷用于誘導hPDLSCs成骨分化，發現了淫羊藿苷可以促進hPDLSCs的增殖及骨向分化，提示淫羊藿苷代替常規生長因子應用于牙周組織工程具有一定可行性。杜仲為我國特有杜仲科植物，功效為補肝腎，強筋骨。研究發現杜仲具有提高成骨細胞的活性，抑制骨吸收，提高骨密度，防治骨質疏松，加速骨痂的改建等作用。曾建春等〔11〕通過研究杜仲含藥血清誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞定向分化過程中蛋白的表達差異，發現杜仲可能通過上調波形蛋白、核纖層蛋白A的表達促進細胞分化，下調鈣網織蛋白表達，釋放細胞內鈣，參與礦化過程。

在細胞學研究中，細胞增殖是一個重要的內容，組織的生長、修復與重建都需要依靠細胞的增殖來完成。本實驗說明濃度為10-4，10-5，10-6g/ml的杜仲葉提取物均可促進hPDLSCs的增殖。

hPDLSCs 在礦化誘導條件下，可以表達成牙骨質/成骨樣特性標記物，說明其具有分化為成骨特性細胞的功能。ALP在骨形成和礦化中發揮重要的作用，它被認為是反映成骨活性水平的標志，即當組織中的成骨細胞或某些具有成骨分化特性的細胞開始成骨分化時，ALP的活性可顯著增高〔12〕。Runx2是參與成骨細胞分化和骨形成的關鍵轉錄因子，可以控制許多骨基質蛋白的表達。同樣關鍵的成骨基因OPN，OCN的表達與hPDLSCs形成礦化基質的能力是一致的〔13，14〕，因此也可以作為hPDLSCs成骨分化和礦化能力的特殊標記。

綜上，本實驗先通過MTT評價含質量濃度10-4，10-5，10-6g/ml的杜仲葉提取物的礦化誘導培養基對hPDLSCs增殖的影響，發現一定濃度的杜仲葉提取物可促進hPDLSCs的增殖。后又以同樣濃度范圍的杜仲葉提取物成骨誘導hPDLSCs，以ALP活性和成骨相關基因(Runx2，OPN，OCN)的表達情況，評價其對hPDLSCs成骨分化的影響，結果顯示相同濃度的杜仲葉提取物也可促進hPDLSCs成骨分化。本實驗為體外杜仲促進人牙周膜干細胞增殖及成骨分化奠定了實驗基礎，也為進一步杜仲應用于臨床治療牙周組織疾病及修復骨組織缺損提供了實驗依據。