長鏈非編碼RNA CASC2通過靶基因miR-514b-5p調控結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的作用機制

李豪 姬發祥 徐曉寧 馬金華 沈存芳 李進章 王麗娟

(青海大學附屬醫院腫瘤內科，青海 西寧 810000)

結直腸癌是常見的消化道腫瘤，其發病率和死亡率不斷上升〔1〕；是世界第3高發惡性腫瘤，嚴重威脅人類的健康〔2〕。現在其主要治療方式是手術、放療和化療〔3〕，新型的分子靶向治療藥物貝伐單抗、西妥昔單抗的聯合應用對于結直腸癌有良好的療效〔4〕。因此，分子靶向治療對結直腸癌的治療具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200 nt的非編碼RNA，近年來研究發現lncRNA廣泛參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲遷移等〔5，6〕。lncRNA HOTAIR在結直腸癌中高表達會增加細胞侵襲，易出現肝臟轉移且預后較差〔7〕。

腫瘤易感候選基因(CASC)2是lncRNA的一種，最初在子宮內膜癌中發現，呈下調表達有抑癌作用〔8，9〕。研究發現CASC2在肺癌〔10〕、肝癌〔11〕、結腸癌〔12〕、食管癌〔13〕、胰腺癌〔14〕、胃癌〔15〕、腎細胞癌〔16〕、膀胱癌〔17〕、膠質瘤〔18〕、甲狀腺癌〔19〕中下調表達有抑癌作用，可作為腫瘤診治的生物學標志物。lncRNA除了直接參與基因的表達調控外，也可作為一種競爭性內源RNA與miRNA相互調控，共同參與靶基因的表達，并在腫瘤的發生發展中發揮重要作用〔20，21〕。本研究探尋lncRNA CASC2對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，分析CASC2和miR-514b-5p的靶向關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460和結直腸癌細胞SW480均購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；細胞計數試劑盒(CCK)-8購自碧云天生物技術研究所；細胞板、酶標儀購自賽默飛公司；倒置顯微鏡購自Olympus公司。

1.2細胞培養 人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460和結直腸癌細胞SW480常規培養于含10% FBS的RPMI1640培養基，置于37℃，含5% CO2恒溫箱培養。每2～3 d傳代一次。

1.3細胞轉染和分組 取常規培養的人乳腺癌細胞SW480消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。轉染分為pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-CASC2組(轉染pcDNA-CASC2 mimics)、si-NC組(轉染si-NC)、si-CASC2組(轉染si-CASC2)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-514b-5p組(轉染anti-miR-514b-5p)、pcDNA-CASC2+miR-NC組(共轉染pcDNA-CASC2 mimics和miR-NC)、pcDNA-CASC2+miR-514b-5p組(共轉染pcDNA-CASC2 mimics和miR-514b-5p)，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.4qRT-PCR分析CASC2及miR-514b-5p表達 按照說明書提取總RNA，用反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按照qPCR說明書進行qRT-PCR方法擴增。循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5CCK-8法測定SW480細胞增殖 分別取pcDNA組、pcDNA-CASC2組、anti-miR-NC組、anti-miR-514b-5p組、pcDNA-CASC2+miR-NC組和pcDNA-CASC2+miR-514b-5p組對數生長期細胞的消化后，接種于96孔板(5×103個/孔)培養，分別于24、48和72 h培養時間點，每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續孵育2 h。酶標儀測定各孔490 nm波長處OD值。每組重復3次取平均值，另設單孔只加培養基作空白對照。細胞增殖活力(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 收集pcDNA組、pcDNA-CASC2組、anti-miR-NC組、anti-miR-514b-5p組、pcDNA-CASC2+miR-NC組和pcDNA-CASC2+miR-514b-5p組穩定表達的SW480細胞，配制不含血清的細胞培養液，饑餓去血清后取適量懸液加入Transwell小室上層(3×105個/孔)，下室加含有趨化因子的培養基，繼續培養48 h。用棉簽擦去上室內的細胞，再用0.1%的結晶紫染色；細胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入基質膠Matrigel，凝固后接種SW480細胞，之后和細胞遷移操作相同。顯鏡下隨機選取5個視野進行細胞的觀察、計數。

1.7熒光素酶報告基因檢測 CASC2對miR-514b-5p的轉錄調控 TargetScan數據庫顯示CASC2 3′UTR區域有miR-613結合位點。構建野生型和突變型基因靶點CASC2的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-CASC2和MUT-CASC2)，取對數生長期SW480細胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-CASC2和MUT-CASC2組細胞分別轉染miR-NC和miR-514b-5p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次。

1.8統計學分析 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1CASC2和miR-514b-5p在SW480細胞和NCM460細胞中的表達 與NCM460組相比，SW480組細胞中CASC2表達顯著下降；miR-514b-5p的表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 CASC2和miR-514b-5p在SW480細胞和NCM460細胞中的表達

2.2CASC2過表達對結直腸癌SW480細胞增殖的影響 CCK-8法檢測結果顯示，在轉染pcDNA、pcDNA-CASC2后，分別于24、48、72 h時檢測細胞增殖，與pcDNA組相比，在48 h和72 h時pcDNA-CASC2組SW480細胞活性顯著降低(P<0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，相較于pcDNA組，pcDNA-CASC2組CASC2的表達顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 CASC2過表達對結直腸癌SW480細胞增殖的影響

2.3CASC2過表達對結直腸癌SW480細胞遷移、侵襲的影響 Transwell 法檢測結果顯示，相較于pcDNA組，pcDNA-CASC2組結直腸癌SW480細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 CASC2過表達對結直腸癌SW480細胞遷移、侵襲的影響個)

2.4抑制miR-514b-5p表達對結直腸癌SW480細胞增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，相較于anti-miR-NC組，anti-miR-514b-5p組結直腸癌SW480細胞miR-514b-5p的表達顯著降低(P<0.05)。CCK-8法檢測結果顯示，相較于anti-miR-NC組，anti-miR-514b-5p組結直腸癌SW480細胞在作用48 h和72 h時細胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell法檢測結果顯示，相較于anti-miR-NC組，anti-miR-514b-5p組結直腸癌SW480細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 抑制miR-514b-5p表達對結直腸癌SW480細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5CASC2靶向調控miR-514b-5p的表達 通過TargetScan數據庫預測到CASC2與miR-514b-5p存在結合位點(圖1)。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示，轉染野生型CASC2基因表達載體WT-CASC2后，相較于miR-NC組，miR-514b-5p組WT-CASC2乳腺癌細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型CASC2基因表達載體MUT-CASC2后，相較于miR-NC組，miR-514b-5p組MUT-CASC2 乳腺癌細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。qRT-PCR檢測結果顯示，相較于si-NC組(0.96±0.09)，si-CASC2組乳腺癌細胞中miR-514b-5p的表達水平(2.14±0.17)顯著升高(P<0.05)；而相較于pcDNA組(1.03±0.08)，pcDNA-CASC2組乳腺癌細胞中miR-514b-5p的表達水平(0.52±0.05)顯著降低(P<0.05)。

表5 雙熒光素酶報告實驗

圖1 CASC2的3′UTR中含有與miR-51b-5p互補的核苷酸序列

2.6miR-514b-5p過表達逆轉了CASC2過表達對SW480細胞增殖、遷移、侵襲的作用 CCK-8法檢測結果顯示，在轉染pcDNA、pcDNA-CASC2、pcDNA-CASC2+miR-NC和pcDNA-CASC2+miR-514b-5p后，在48 h和72 h時，相較于pcDNA組，pcDNA-CASC2組SW480細胞活性顯著降低(P<0.05)；而相較于pcDNA-CASC2+miR-NC組，pcDNA-CASC2+miR-514b-5p組SW480胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，相較于pcDNA組，pcDNA-CASC2組SW480細胞遷移和侵襲數顯著降低(P<0.05)；而相較于pcDNA-CASC2+miR-NC組，pcDNA-CASC2+miR-514b-5p組SW480細胞遷移和侵襲數顯著升高(P<0.05)。見表6。

表6 miR-514b-5p過表達逆轉了CASC2過表達對SW480細胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

結直腸癌嚴重威脅人類生命健康，其治療方式主要是手術和放化療，而近年來分子靶向治療有良好的療效，明顯改善患者生存質量〔22〕。所以確定更多更精確的靶點，對更有效的結直腸癌診斷治療和預后意義重大。lncRNA可作為腫瘤臨床診斷標志物和治療靶點〔23〕。研究發現，lncRNA CASC2作為競爭性內源RNA調控miR-18a，在結腸直腸癌中發揮作用〔12〕；CCAT2在結直腸癌中高表達，促進腫瘤生長和遷移，誘導染色體不穩定〔24〕。CASC2通過靶向miR-18a-5p調節PTEN的表達抑制食管癌腫瘤的增殖和侵襲〔25〕。研究發現，CASC2能負向調控miR-24-3p抑制肝癌細胞的活力，促進其凋亡〔26〕；CASC2通過調控miR-367影響下游靶基因進而抑制肝癌細胞的遷移和侵襲〔27〕；CASC2通過miR-21抑制人神經膠質瘤的生長〔28〕；CASC2通過抑制SOX4抑制肺腺癌的遷移和上皮至間充質轉變〔29〕。HNF1A/CASC2通過PTEN/Akt信號傳導調節胰腺癌細胞增殖〔30〕；CASC2通過調節MAPK信號傳導途徑抑制胃癌細胞的增殖〔15〕。

miRNA參與多種生物學功能，miR-100-5p和miR-199b-5p通過靶向mTOR誘導結腸癌細胞自噬〔31〕。miR-18b-5p在大腸癌中高表達，通過下調PTEN的表達，激活PI3K/Akt2信號轉導通路促進大腸癌的發生發展〔32〕。miR-499-5P在結腸癌中高表達，參與結腸癌早期的發生發展，與淋巴結的轉移有關〔33〕。miR-514b-5p通過促進上皮細胞-間充質轉化促進結直腸癌的遷移〔34〕。miR-513b-5p〔35〕、miR-139-5p〔36〕、miR-338-5p〔37〕可以通過阻滯細胞周期，促進細胞凋亡等抑制結腸癌細胞的增殖、遷移與侵襲。

本研究發現，lncRNA CASC2可抑制結直腸癌SW480細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與靶向調節miR-514b-5p的表達有關，對CASC2調控作用機制的研究將可為結直腸癌的預防診斷、預后評估及靶向治療提供新的理論依據和干預靶點。