近地層臭氧濃度升高對大豆葉片氮代謝及產量的影響

牟琳，王巖，孫銘禹，周映彤，莊永輝，趙天宏

沈陽農業大學農學院，遼寧 沈陽 110000

近地層臭氧（O3）是太陽輻射下，由氮氧化物、揮發性有機化合物和一氧化碳反應而形成的二次光化學空氣污染物（Pleijel et al.，2019）。近年來，由于工業化和城市化的快速發展，導致氮氧化物的排放量增加進而導致對流層臭氧濃度顯著增加（Luo et al.，2020；Feng et al.，2015）。對流層中，由于強烈的氧化作用，高濃度水平的臭氧對人類和動、植物造成損害（趙天宏等，2013；Young et al.，2020）。臭氧污染限制作物生產力，損傷植株葉片（Bailey et al.，2019）。目前，有研究表明臭氧污染會嚴重降低作物的產量，2008—2010年間，大豆（Glycine max）產量約損失 2%—10%，西方小麥（Triticum aestivum）產量損失約為0—27%，亞洲小麥約為4%—39%，相比西方小麥，亞洲小麥對臭氧的敏感性更高（Schauberger et al.，2019）。

氮（N）是影響作物生產力的重要養分之一，大豆籽粒產量與全氮的吸收呈正相關（Santachiara et al.，2019）。研究表明，大豆籽粒產量和蛋白質濃度在生理上與大豆積累的氮有關（Nicolas et al.，2019；Sinclair et al.，2006）。氮代謝是植物生理反應的最根本過程，是氮在植株體內流動的途徑，為植株的不同部位提供營養元素。氮代謝過程中，植物將外界環境的無機氮通過一些酶（硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶等）轉化成植物可以吸收利用的有機氮（許振柱等，2004）。氮代謝途徑包括3個：一是氮的無機同化，二是氨的同化，三是氨的有機同化（王乾欽，2011）。近年來，有研究表明，臭氧脅迫導致水稻（Oryza sativa）和小麥在生長發育過程中代謝途徑及其功能受到影響，其葉片碳代謝途徑受到促進而氮代謝途徑受到抑制，進而造成水稻和小麥中參與其葉片氮的無機同化過程的硝酸還原酶活性和硝態氮含量隨著臭氧濃度的升高而顯著下降，小麥葉片經氨的有機同化形成的游離氨基酸含量顯著升高，同時，臭氧脅迫對水稻根系和小麥葉片經氮代謝而形成的可溶性蛋白具有一定的抑制作用，進而導致根系活力衰退（黃益宗等，2012；黃益宗等，2013；鄭有飛等，2013；張巍巍等，2009）。此外，臭氧脅迫下如毛竹（Phyllostachys pubescens）等植物會形成適應性的反應，臭氧濃度成倍增加處理后的毛竹經氮代謝而形成的可溶性蛋白含量顯著增加（莊明浩等，2012）。

大豆是一種重要的經濟作物，被認為是人民生活中最重要的糧食作物和油料作物，大豆蛋白質含量較高，同時也是對臭氧較為敏感的作物之一（Ullah et al.，2019；Sulieman et al.，2019；馬莉，2018）。關于臭氧脅迫對大豆葉片氮代謝及產量的研究較少，本研究選用“鐵豐 29號”大豆為試驗材料，采用盆栽試驗，在開頂式氣室（OTCs）中通過增加臭氧濃度對大豆進行臭氧熏蒸，探討近地層臭氧濃度升高條件下，大豆葉片內氮代謝相關指標和大豆產量的響應機制，為大豆生產應對臭氧濃度增加提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以“鐵豐29號”栽培大豆為試驗材料，此品種大豆屬于雜交品種，葉片肥厚且濃綠，幼莖紫色，其具有長達130—133 d的生育期，適宜種植于中等或中等以上肥力的土壤中。試驗所用土壤類型主要為草甸棕壤，土壤（0—20 cm）理化性質為全 P 0.57 g·kg-1，全 K 22.17 g·kg-1，全 N 1.18 g·kg-1，有機質 12.03 g·kg-1。

1.2 試驗設計

于中國科學院沈陽農田生態系統國家野外站進行室外種植試驗，在沈陽農業大學生態學實驗室進行室內指標測定試驗。在開頂式氣室（OTCs）內進行大豆抽樣蒸熏試驗，OTCs長1.15 m，高2.4 m，橫截面為正八邊形并具有玻璃室壁。此外，試驗中還用到的設備有O3發生器（中國，BGY-Q8，北理國科）、O3傳感器（新西蘭，S-900，艾爾科）以及數據分析與自動控制充氣系統。試驗期間，實際控制氣室內氣體濃度穩定（武紅艷，2019）。

本試驗采用傳統的盆栽試驗，在 PVC桶（高30 cm、直徑33 cm）內進行種植，根據大田種植密度及PVC桶的面積計算出每桶播種8粒大豆種子，出苗后保留5株，2019年5月初播種，熏蒸試驗于大豆出苗20 d后開始進行，每天熏蒸9 h（08:00—17:00），大豆成熟時停止熏蒸。設置3個不同水平的O3熏蒸處理，分別為CK（對照，O3濃度為45 nL·L-1）、T1（O3濃度升高，即 O3濃度 (80±10)nL·L-1）、T2（O3濃度升高，即 O3濃度 (120±10)nL·L-1），每個氣室內3次重復。試驗期間保證水分和肥料的一致，為防止氮肥的缺少或過多，在種植前施用硫酸鉀（75 kg·hm-2）、尿素（105 kg·hm-2）、磷酸二銨（285 kg·hm-2），此外控制病蟲害及雜草的影響。大豆取樣期為分枝期（2019年7月22）、開花期（2019年8月9號）和結莢期（2019年9月2號）。

1.3 材料采集

采集后的大豆植株樣品，立即用清水沖洗干凈，將植株表面多余的水分用吸紙吸收干凈，將植株分離成根、莖、葉等3個部分，其中一部分根、莖、葉剪碎后置于烘箱內，105 ℃殺青30 min后，80 ℃烘干至恒質量，用于干質量的測定；另一部分根、莖、葉用于指標測定。結莢期，收取大豆籽粒進行產量測定。

1.4 測定指標及方法

葉片氮代謝相關指標的測定：硝酸還原酶（NR）活性測定采用活體法（張志良，2016），谷氨酰胺合成酶（GS）測定采用鄒琦（2003）的方法，谷氨酸合酶（GOGAT）測定參考張韞璐（2018）的方法，硝態氮測定采用水楊酸法（鄒琦，2003），亞硝態氮測定采用王乾欽（2011）的方法并加以改進，游離氨基酸采用水合茚三酮法（王乾欽，2011），可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍 G-250法（鄒琦，2003），產量測定采用分析天平稱重法。

1.5 數據處理分析

本試驗數據運用Microsoft Excel 2016軟件進行處理，運用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），檢驗臭氧濃度升高對大豆葉片氮代謝相關指標及產量的影響，對大豆葉片氮代謝相關指標進行Pearson相關性分析。實驗數據采用平均值±標準差，3次重復。

2 結果與分析

2.1 臭氧濃度升高對大豆葉片氮代謝相關指標的影響

2.1.1 臭氧濃度升高對大豆葉片硝酸還原酶（NR）的影響

圖1 臭氧濃度升高條件下大豆葉片硝酸還原酶活性Fig. 1 Nitrate reductase activity of soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

由圖1可知，大豆葉片硝酸還原酶活性在臭氧脅迫下存在下降趨勢。分枝期，T1和 T2條件下，與 CK相比，大豆葉片硝酸還原酶活性分別下降63.48%和68.17%，且存在顯著差異（P＜0.05），但T1和T2處理間差異不顯著。開花期和結莢期，CK、T1和 T2兩兩之間差異顯著（P＜0.05），其中開花期在T1和T2條件下，分別顯著下降50.56%和71.79%，結莢期在T1和T2條件下，分別顯著下降51.20%和75.39%。

2.1.2 臭氧濃度升高對大豆葉片谷氨酰胺合成酶（GS）的影響

圖2 臭氧濃度升高條件下大豆葉片谷氨酰胺合成酶活力Fig. 2 Glutamine synthetase activity of soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

由圖2可知，在臭氧脅迫下，與CK相比，T1和T2條件下，葉片谷氨酰胺合成酶活力呈現出下降趨勢。分枝期，T1和T2條件下，與CK相比大豆葉片谷氨酰胺合成酶活力分別下降28.62%和49.51%，且差異顯著（P＜0.05）。開花期，與 CK 相比，T1和T2條件下，大豆葉片谷氨酰胺合成酶活力分別顯著下降30.53%和53.69%，且差異顯著（P＜0.05），但T1和T2處理間差異不顯著。結莢期，CK和T1相比，大豆葉片谷氨酰胺合成酶活力差異不顯著，T1條件下，略下降9.72%，CK和T2相比、T1和T2相比，大豆葉片谷氨酰胺合成酶活力差異顯著（P＜0.05），與CK和T1相比，T2條件下，大豆葉片谷氨酰胺合成酶活力分別顯著下降 22.92%和14.62%。

2.1.3 臭氧濃度升高對大豆葉片谷氨酸合酶（GOGAT）的影響

由圖3可知，分枝期、開花期和結莢期，臭氧濃度升高條件下大豆葉片谷氨酸合酶活力整體下降。分枝期，T1和 T2條件下時，大豆葉片谷氨酸合酶活力與 CK相比分別顯著下降 49.44%和73.61%（P＜0.05）。開花期，T1和T2條件下時，大豆葉片谷氨酸合酶活力與 CK相比分別顯著下降29.03%和61.83%（P＜0.05）。結莢期，T1和T2條件下，大豆葉片谷氨酸合酶活力與CK相比分別顯著下降33.91%和54.60%（P＜0.05）。

圖3 臭氧濃度升高條件下大豆葉片谷氨酸合酶活力Fig. 3 Glutamate synthetase activity of soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

2.1.4 臭氧濃度升高對大豆葉片硝態氮的影響

由圖4可知，分枝期，T1和 T2條件下，大豆葉片硝態氮含量與 CK相比顯著降低，分別達到19.25%和 76.81%，且 T1和 T2相比差異性顯著（P＜0.05）。開花期，T1和T2條件下，大豆葉片硝態氮含量與 CK相比顯著下降，分別下降 37.52%和60.62%，且T1和T2相比差異性顯著（P＜0.05）。結莢期，T1和T2條件下，大豆葉片硝態氮含量與CK相比分別顯著下降 29.30%和 82.08%，且 T1和 T2間差異性顯著（P＜0.05）。

2.1.5 臭氧濃度升高對大豆葉片亞硝態氮的影響

圖4 臭氧濃度升高條件下大豆葉片硝態氮含量Fig. 4 The content of nitrate nitrogen in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

圖5 臭氧濃度升高條件下大豆葉片亞硝態氮含量Fig. 5 The content of nitrite nitrogen in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

由圖 5可知，分枝期，與 CK相比，T1和 T2條件下，大豆葉片亞硝態氮含量分別顯著降低82.83%和 91.68%（P＜0.05），但 T1和 T2間差異不顯著。開花期，與CK相比，T1和T2條件下，大豆葉片亞硝態氮含量分別顯著降低68.71%和75.13%（P＜0.05），但 T1和 T2間差異不顯著。結莢期，T1和T2條件下，大豆葉片亞硝態氮含量與CK相比分別顯著下降14.74%和54.39%，同時，T1和T2間差異性顯著（P＜0.05）。

2.1.6 臭氧濃度升高對大豆葉片游離氨基酸的影響

由圖 6可知，分枝期，T1和T2條件下，大豆葉片游離氨基酸含量與 CK相比分別顯著降低44.11%和56.87%（P＜0.05）。開花期，T1和T2條件下，大豆葉片游離氨基酸含量與CK相比分別下降11.94%和47.27%，且T2條件下差異顯著，T1和T2處理間差異顯著（P＜0.05）。結莢期，T1和T2條件下，大豆葉片游離氨基酸含量與CK相比分別顯著下降 30.08%和 45.11%，且 T1和 T2間差異顯著（P＜0.05）。

圖6 臭氧濃度升高條件下大豆葉片游離氨基酸含量Fig. 6 The content of free amino acids in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

圖7 臭氧濃度升高條件下大豆葉片可溶性蛋白含量Fig. 7 The content of soluble protein in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

2.1.7 臭氧濃度升高對大豆葉片可溶性蛋白的影響

由圖7可知，分枝期，T1和 T2條件下，大豆葉片可溶性蛋白含量與 CK相比分別顯著下降23.11%和69.54%（P＜0.05），同時，T1和T2處理間差異顯著（P＜0.05）。開花期，與 CK 相比，T1和T2條件下分別下降11.31%和56.70%，且T2條件下差異顯著，T1和T2處理間差異顯著（P＜0.05）。結莢期，與 CK相比，T1和 T2條件下分別顯著下降47.22%和 79.55%，且 CK、T1和 T2兩兩之間均差異顯著（P＜0.05）。

2.2 臭氧濃度升高對大豆產量的影響

由表1可知，大豆在臭氧脅迫條件下，受到臭氧的影響，其單株莢數、單株粒數和百粒質量在T1和T2處理下差異不顯著，分別與CK比較差異顯著（P＜0.05），單株粒質量在CK、T1和T2兩兩之間差異均顯著（P＜0.05）。與CK相比，T1和T2處理下，大豆單株莢數下降幅度分別達到24.15%和33.62%，單株粒數下降幅度分別達到27.85%、37.50%，單株粒質量下降幅度分別達到20.93%和39.73%，百粒質量下降幅度分別達到8.20%和7.93%。T1條件下，臭氧脅迫對大豆單株粒數影響最大，其次是單株莢數和單株粒質量，T2條件下，臭氧脅迫對單株粒質量的影響最大，其次是單株粒數和單株莢數，而相比之下，臭氧濃度升高對于百粒質量影響相對較小。

表1 臭氧濃度升高條件下大豆產量Table 1 Soybean yield under the condition of increased ozone concentration

2.3 臭氧濃度升高條件下大豆葉片氮代謝相關指標間及產量的相關性

由表2可知，臭氧濃度升高條件下，大豆葉片氮代謝相關指標間相關性各有不同，硝酸還原酶與亞硝態氮呈顯著正相關（P＜0.05），且相關程度處于中度相關；與游離氨基酸呈正相關但不顯著，相關程度處于中度相關；與谷氨酰胺合成酶呈正相關但不顯著，相關程度處于中度相關且相關系數略低于硝酸還原酶與游離氨基酸的相關系數；與谷氨酸合酶正相關但不顯著，相關程度處于低度相關；與硝態氮和可溶性蛋白不相關。硝態氮與可溶性蛋白呈極顯著正相關（P＜0.01），相關程度處于高度相關；與谷氨酸合酶呈顯著正相關（P＜0.05），相關程度處于中度相關；與亞硝態氮、游離氨基酸、谷氨酰胺合成酶不相關。亞硝態氮與游離氨基酸呈顯著正相關（P＜0.05），相關程度達到中度相關；與谷氨酰胺合成酶極顯著正相關（P＜0.01），相關程度達到中度相關；與谷氨酸合酶低度正相關但不顯著；與可溶性蛋白不相關。游離氨基酸與可溶性蛋白達到中度負相關；與谷氨酰胺合成酶達到極顯著的高度正相關（P＜0.01）；與谷氨酸合酶不相關。可溶性蛋白與谷氨酰胺合成酶達到低度負相關；與谷氨酸合酶不相關。谷氨酰胺合成酶與谷氨酸合酶呈高度正相關。參與大豆氮代謝的硝酸還原酶、硝態氮、亞硝態氮、游離氨基酸、可溶性蛋白、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶均與產量達到高度正相關，且谷氨酰胺合成酶與產量之間具有顯著相關性。

3 討論

葉片是植物生長過程中，受外界影響較大的部位，葉片的營養元素氮及生長情況與植物內在生理因素和外在環境因素（光照、溫度、水分和外界干擾等）均有關系。氮代謝途徑傳遞植物體內的氮，影響植物生長所需的重要營養元素，總結其過程如下：

表2 大豆葉片氮代謝相關指標間及產量的相關性Table 2 Correlation between indexes of nitrogen metabolism and yield in Soybean Leaves

硝酸還原酶是一種限速酶，參與植物氮代謝途徑并調節硝酸鹽同化，對農作物的產量和品質有著重要的影響，可被看作植物營養的重要指標之一（趙念席等，2014）。目前關于氮素對于植物硝酸還原酶活性影響的研究較多，但關于臭氧脅迫處理的研究較少。王菲等（2019）研究表明，高氮處理下的煙草（Nicotiana tabacum）幼苗硝酸還原酶活性先降低后升高。于鐵峰等（2017）研究表明，紫花苜蓿（Medicago sativa）葉片的硝酸還原酶活性隨著氮水平的增加呈先增大后減小的趨勢。本研究表明，臭氧升高條件下，大豆葉片的硝酸還原酶活性在分枝期、開花期和結莢期均逐漸降低，且活性差異變化顯著。目前已有張治安（2007）研究表明大豆葉片含氮量與光合作用關系密切，大豆硝酸還原酶活性與光合速率正相關，同時張銘等（2019）研究表明臭氧脅迫導致大豆光合速率降低，抑制光合作用能力，致使大豆產量降低。因此，臭氧脅迫導致本試驗結果的原因可能是臭氧污染影響大豆葉片光合速率，導致光合作用受到抑制，大豆葉片的氮循環受阻，進而影響大豆葉片的硝酸還原酶活性。硝酸還原酶在大豆葉片內將硝態氮還原成亞硝態氮，本研究中，大豆葉片硝態氮和亞硝態氮含量在分枝期、開花期和結莢期，臭氧濃度升高處理下均顯著下降，可能與黃益宗等（2013）研究認為由于臭氧污染對土壤氮循環過程中涉及到的微生物造成影響，降低了土壤中的硝態氮含量，進而影響水稻葉片的硝態氮含量的原因相似，但亞硝態氮在分枝期和開花期，T1和T2臭氧處理下差異不明顯，到了結莢期才出現顯著差異，這表明T2濃度下的臭氧在大豆生育后期對大豆亞硝態氮的影響積累達到最大程度。

谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶在大豆葉片氮代謝途徑中占據重要地位，同時二者受光合作用和呼吸作用的影響。本研究中，在臭氧熏蒸下的大豆葉片的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性降低，且部分差異顯著。可能是因為谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶存在于植物葉綠體中，與光照強度、光合作用和光呼吸有關（許振柱等，2004），而金東艷等（2009）研究表明，臭氧對于大豆葉片的光合作用抑制顯著，因此臭氧熏蒸降低了大豆葉片的光合作用從而導致合成谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的物質減少。

游離氨基酸是大豆葉片氮素水平狀況的一種體現，與植物體內的氮代謝關系密切（張鑫，2010）。可溶性蛋白是大豆生長的重要養分。本研究中，大豆葉片的游離氨基酸含量隨著大豆的生長呈現出先增后減的趨勢。在臭氧脅迫下，大豆葉片的游離氨基酸處于顯著下降的狀態，這與Sun et al.（2014）關于臭氧暴露下大豆游離氨基酸含量隨著臭氧濃度的增加而降低的研究結果一致，但開花期且臭氧濃度處于T1條件下時，游離氨基酸下降不顯著且含量高于分枝期和開花期，說明此時大豆葉片抵御臭氧脅迫的能力較強。此外，本研究中，在大豆生長到結莢期時，大豆葉片可溶性蛋白含量很高。在臭氧污染下，可溶性蛋白的含量下降，部分達到了極顯著的情況，這與鄭有飛等（2013）關于小麥葉片可溶性蛋白含量隨著臭氧濃度的增加而降低的研究結果相似，可能是由于氮代謝途徑中合成可溶性蛋白所需的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性在臭氧脅迫下受到抑制所導致。同時，根據本研究的相關性分析可見，臭氧濃度升高條件下大豆葉片氮代謝過程中各個指標間具有一定的關聯性。大豆葉片氮代謝關鍵酶受到臭氧脅迫時，則會導致氮代謝過程受到阻礙，進而導致其他氨基酸、蛋白質等物質受到顯著的抑制作用。

有研究表明，臭氧脅迫影響大豆的氣孔進而對大豆產量的影響明顯（Zhang et al.，2017）。同時，有大量研究結果表明，地面臭氧濃度升高會損害玉米、大豆等農作物并造成產量降低（Mcgrath et al.，2015；Shalini et al.，2011）。本研究 T1條件下，大豆籽粒單株莢數、單株粒數、單株粒質量和百粒質量就出現了顯著的降低，這說明臭氧脅迫對大豆產量的影響明顯，這與田榮榮等（2016）研究結果相似，可能是臭氧抑制了大豆氮代謝途徑，降低大豆的抗氧化性，大豆氮素供應不足，最終導致植株受損，籽粒減產。

4 結論

大豆葉片氮代謝指標和指標間、指標和產量間具有一定的相關關系，且大部分達到中度及以上相關關系。臭氧濃度升高顯著降低了大豆葉片的硝酸還原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性、谷氨酸合酶活性、硝態氮含量、亞硝態氮含量、游離氨基酸含量以及可溶性蛋白含量。臭氧濃度升高導致大豆的單株莢數、單株粒數、單株粒質量和百粒質量顯著降低。說明高濃度臭氧抑制了大豆葉片的氮代謝功能，降低了大豆葉片生長所需的蛋白質含量，進而導致大豆生長情況受到影響，大豆產量顯著降低。