普通級實驗犬微生物學、寄生蟲學控制標準介紹

盛雅潔，肖春蘭，趙麗娟，周正宇

（蘇州大學 實驗動物中心，江蘇 蘇州 215123）

犬作為實驗動物在解剖、生理以及代謝等生命科學的各個領域中起著至關重要的作用，因此廣泛應用于各項科學研究[1]。但是實驗犬的飼養往往多采用群體飼養，容易感染狂犬病、布魯桿菌以及弓形蟲感染等一系列人畜共患病，這些人畜共患病不僅直接影響到實驗犬的健康，還會對相關工作人員生命健康造成一定的威脅[2]。實驗犬的國家標準在提高實驗犬的質量、保障相關科學研究中起了至關重要的作用。微生物學、寄生蟲學質量控制是衡量實驗動物質量的主要標準之一。關于實驗犬質量的實驗動物國家標準，包括微生物學和寄生蟲學控制標準[3]。該標準的實施促進了實驗犬檢測技術與檢測體系的發展，并達到了一定的標準化水平[4]。本文對實驗犬的微生物學和寄生蟲學質量控制的標準以及具體檢測方法進行了相應的整理歸納。

1 檢測規則

根據國標要求，普通級實驗犬每3個月至少檢測1次，要求選取成年動物進行檢測。此外，國標對選取動物數量也進行了規定，取樣數量由生產繁殖單元大小決定，要求群體大小＜100只時，取樣數量應＞5只；群體大小在100～500只時，取樣數量＞10只；群體大小＞500只時，要求取樣數量＞20只。此外，在實際檢測過程中，還往往要求取樣時雌雄各半，因為雌性動物跟雄性動物對不同病原體的敏感程度存在一定的差異。

2 采樣方法

首先對待檢實驗犬進行編號，然后進行外觀檢查，之后對不同病原體采取分別進行取樣，包括皮膚毛發，血液以及糞便或者肛拭子。

2.1 毛發取樣

采取用透明膠帶粘取犬的毛發或者直接用鑷子在實驗犬的易感染部位拔取少許被毛，散放于載玻片上，用透明膠帶壓住（或加一滴生理鹽水后，覆以蓋玻片），編號待檢。

2.2 刀片刮取皮層物取樣

檢測皮層內寄生螨類時還需用刀片刮取動物潰瘍部位深層碎屑或擠破膿瘡取其內容物，置于載玻片上，滴加氫氧化鈉液化或者甘油使之透明后編號待檢。

2.3 采血

國標推薦的采血方式為耳部無菌采血，但是實際操作中犬前肢臂頭靜脈更粗一點，并且位置好找，容易操作，往往采用前肢臂頭靜脈采血。血液需4℃冰箱過夜后分離血清，56℃恒溫水浴滅活30 min后進行后續試驗。

2.4 糞便或肛拭子

采集時應采集新鮮糞便或直接用無菌棉簽采集肛拭子，置于無菌離心管中編號待檢。

3 檢測項目及標準

包括微生物學和寄生蟲學控制標準，具體檢測項目、檢測依據及技術要求見表1。

表1 普通級實驗犬質量控制標準及要求

3.1 微生物學質量控制

普通級實驗犬的病原菌必須檢測項目包括沙門菌、皮膚病原真菌、布魯桿菌，檢測標準分別為GB/T14926.1-2001,GB/T14926.4-2001以及GB/T14926.45-2001。

犬沙門菌又稱犬副傷寒，是一種常見的人畜共患病，臨床癥狀主要為嘔吐、腹瀉[5]。實驗犬沙門菌的檢測通常采集糞便或肛拭子，然后接種SS或DHL培養基進行直接分離培養，或者接種SF增菌液后轉至SS或DHL培養基進行培養，挑選可疑菌落增菌后通過菌落形態、菌體特征以及生化反應進行鑒定。沙門菌在DHL和SS培養基上均形成無色透明表面光滑濕潤的菌落，部分菌落帶黑心。顯微鏡下沙門菌為革蘭陰性桿菌，無芽孢，無莢膜。生化反應包括硫化氫試驗、靛基質試驗、尿素培養基試驗、氰化鉀培養及試驗以及賴氨酸脫氫酶培養基試驗，目前很多檢驗檢疫機構多采用了全自動或半自動微生物檢定儀進行鑒定，雖然前期儀器成本較為昂貴，但是可以更加方便快捷準確地對細菌進行鑒定，節省了不少人力物力。

皮膚病原真菌感染犬容易引起真菌性皮膚病，出現脫毛、皮膚瘙癢等癥狀。犬孢子菌和須毛癬菌是感染犬的最常見皮膚病原真菌[6]。皮膚病原真菌的檢測則是刮取動物皮毛、鱗屑直接涂片或者通過培養基分離培養然后觀察菌落形態進行檢測。直接檢查是將樣本置于載玻片后滴加氫氧化鉀二甲基亞砜液，蓋上蓋玻片10～15 min后顯微鏡下觀察。分離培養則是將樣本接種沙氏培養基，28℃恒溫培養7～14 d后觀察菌落形態，并進行涂片鏡檢。

布魯桿菌是一種胞內寄生的病原菌，主要感染犬的淋巴系統和生殖系統，也是一種較為嚴重的人畜共患病[7]。布魯桿菌的檢測則是通過血清學方法進行，“S（光滑）型”和“R（粗糙）型”布魯桿菌是犬必須排除的病原菌，國標根據布魯桿菌標準抗原與犬血清試管凝集效價判定犬是否感染布魯桿菌。試驗方法包括“S”抗原試管凝集試驗以及“R”抗原試管凝集試驗。國標要求通過檢測血清中布魯桿菌抗體來檢測實驗犬是否感染布魯桿菌，檢測結果要求陰性。此外，中國實驗動物協會還建立了布魯桿菌檢測的PCR方法的團體標準，可以更為準確地檢測犬的布魯桿菌。

普通級實驗犬的病毒檢測項目包括狂犬病病毒、犬細小病毒、傳染性犬肝炎病毒以及犬瘟熱病毒。這4種病毒均是急性、烈性、高度接觸性傳染病，犬一旦感染，很容易引起傳染及死亡[8]。檢測標準分別為GB/T14926.56-2008、GB/T14926.57-2008、GB/T14926.58-2008以及GB/T14926.59-2001。值得注意的是只有犬瘟熱病毒的檢測標準是在2001年發布后未經重新修訂過，其余三個均是在2001年頒布標準的基礎上于2008年經修訂后重新發布，并增加了基礎級犬的群體免疫抗體合格率。

狂犬病毒國標推薦的檢測方法為酶聯免疫吸附法，犬肝炎病毒以及犬細小病毒檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗以及血凝抑制試驗，犬瘟熱病毒的檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗以及免疫酶試驗方法。這幾種方法均為血清學方法，由于所有普通級實驗犬均需要免疫，需要通過檢測血清中病毒抗體水平來衡量免疫效果，要求血清中病毒抗體陽性，因此檢測需采用血清學方法進行，不能夠用PCR等方法進行替代，國標要求經檢測后抗體效價達到陽性為合格，其中基礎級犬群體免疫抗體合格率達到70%以上則可判斷為該犬群免疫合格，計算方式如下：免疫抗體合格率=（被檢動物抗體陽性數/被檢動物總數）×100%。

3.2 寄生蟲學質量控制

普通級實驗犬的寄生蟲學檢測標準包括體外寄生蟲（節肢動物）以及弓形蟲，檢測標準分別為GB/T18448.1-2001以及GB/T18448.2-2008。進行體外寄生蟲檢測應先進行肉眼觀察，體外寄生蟲感染嚴重時，可引起犬的脫毛、毛糙甚至由瘙癢引起潰瘍、結痂。檢查時首先進行外觀檢查，尤其要注意耳根、頸后、眼周、腹股溝等易感部位，然后直接拔毛進行取樣或者用透明膠帶粘取毛發進行取樣，顯微鏡下觀察是否有體外寄生進行判定，發現蟲卵、幼蟲、若蟲、成蟲等均判為陽性。

犬的弓形蟲感染一般為隱性感染，但是當機體免疫力減弱時會出現高熱稽留、食欲不振、嘔吐、呼吸困難等臨床癥狀[9]。國標弓形蟲的檢測方法則是通過血清學方法進行采用間接血凝法（IHA）或者間接免疫熒光法，其原理均為抗原抗體特異性反應，形成免疫復合物，檢測血清中弓形蟲抗體，結果要求陰性。

4 小結

在檢測過程中，檢測方法不同、檢測人員的水平均可能會對檢測結果造成一定的差異，因此，所有檢測結果為不合格的病原體均需采用相同或者不同方法重新進行檢測。此外，隨著實驗動物檢測技術體系的不斷發展，很多更為方便、更為準確的方法已用于實驗犬的檢測中來，需要檢測人員不斷學習。

建立質量檢測體系并嚴格按照國家標準進行檢測是實驗犬質量的有效保證。目前，我國實驗犬質量控制的標準已沿用多年，該標準的實施促進了我國實驗犬質量的發展，但是伴隨著檢驗檢測技術的不斷發展，實驗犬的微生物學與寄生蟲學質量標準也需要進行修訂和完善，使之更適用于今后的實驗犬質量的檢測。