牛乳清粉延緩D-半乳糖衰老小鼠衰老的相關(guān)機(jī)制研究

陳興浩，巫首燕，曹佳怡，劉 慶，甘玉芬，張福梅

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，甘肅 蘭州 730030；3.甘南牦牛乳研究院，甘肅 合作 747000）

人口老齡化是當(dāng)前世界各國共同面臨的重大課題。聯(lián)合國《2019世界人口展望》[1]顯示：我國自2002年（65歲及以上的老年人口占總?cè)丝诘?.08%）進(jìn)入“老齡化社會(huì)”，預(yù)計(jì)2025年、2035年分別進(jìn)入“老年社會(huì)”和“超高齡社會(huì)”（ 65歲及以上的老年人口占總?cè)丝诘?4%時(shí)，稱之為“老年社會(huì)”；當(dāng)超過20%即進(jìn)入了“超高齡社會(huì)”）。到21世紀(jì)中葉將有5億人口超過60歲，步入深度老齡化階段[2]。由于醫(yī)療保健、疫苗接種和衛(wèi)生條件的改善我國老齡化人口規(guī)模將在未來很長一段時(shí)間內(nèi)維持持續(xù)增長[3]。為了積極應(yīng)對(duì)這一世界性難題，我國中共中央、國務(wù)院于2019年11月印發(fā)了《國家積極應(yīng)對(duì)人口老齡化中長期規(guī)劃》，推動(dòng)“健康中國”。探究衰老相關(guān)機(jī)制，尋找延緩衰老的方法，維持老年人較高的生活質(zhì)量已成為各行業(yè)的重中之重。

衰老是生物隨著時(shí)間的推移，自發(fā)的必然過程，它是復(fù)雜的自然現(xiàn)象，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)的退行性變和機(jī)能的衰退，適應(yīng)性和抵抗力減退[4，5]。衰老的相關(guān)機(jī)制至今尚未完全闡述，國際公認(rèn)氧化應(yīng)激是發(fā)生衰老的重要原因之一[6-8]。當(dāng)機(jī)體處于不良外界環(huán)境或隨著年齡的增長導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑的動(dòng)態(tài)平衡被打破，更有利于氧化劑的產(chǎn)生，將會(huì)導(dǎo)致構(gòu)成細(xì)胞組織的各種物質(zhì)如糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等發(fā)生氧化反應(yīng)，從而引起變性、交聯(lián)、斷裂等氧化傷害，進(jìn)而引發(fā)疾病。抗氧化劑可清除自由基及抑制脂質(zhì)過氧化，調(diào)整及改善機(jī)體生理功能，從而達(dá)到預(yù)防及治療慢性疾病的目的[9]。

乳清蛋白（whey protein，WP）利用生產(chǎn)干酪和干酪素的副產(chǎn)物——乳清經(jīng)分離、濃縮獲得[10]，是國際公認(rèn)的天然抗氧化劑[11]。乳清蛋白主要包括 β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和糖巨肽及少量的乳過氧化物酶、乳鐵蛋白、β-微球蛋白、溶菌酶、胰島素樣生長因子（IGF）、λ-球蛋白等[12]。乳清蛋白中不僅含有具有廣譜抗微生物和抗菌特性的組分，乳鐵蛋白還可通過胃蛋白酶產(chǎn)生一種抗菌肽，除具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、礦物質(zhì)吸收、修復(fù)損傷等作用外，還具有廣譜抗菌[13，14]、降低血糖和血脂水平等維持機(jī)體健康的作用。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究牛乳清蛋白體內(nèi)外抗氧化性，探討其在延緩D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老中的作用機(jī)制，以期為老年人補(bǔ)充乳清蛋白提高生活質(zhì)量提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性昆明小鼠（由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）。

超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司；VC、D-半乳糖購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀、高速冷凍離心機(jī)購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；蛋白印跡免染檢測(cè)分析系統(tǒng)購自時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳清蛋白的制備 將鮮牛乳于低溫離心機(jī)（4℃），5 000 r/min，離心30 min。獲得上層乳脂部分和下層乳清、乳粒部分。棄去上層乳脂，脫脂乳在室溫下用1M的HCl調(diào)至pH 4.6，40℃水浴20 min，8 000 r/min離心20 min（4℃），收集上清液（乳清）。冷凍干燥，-4℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳對(duì)牛乳清蛋白進(jìn)行分析。

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）按照BIO-RAD公司TGX and TGX Stain-Free Fast Cast說明配置12% SDS-PAGE膠，取蛋白樣與SDS上樣緩沖液（4×）混合，沸水浴10 min，使蛋白變性；上樣；連接好正負(fù)極，起始電壓100 V，約30 min；待其進(jìn)入分離膠，120 V，60 min，至溴酚藍(lán)條帶到達(dá)分離膠底部，使蛋白樣品充分分離。取出凝膠直接放在BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)的黑板上，調(diào)節(jié)好膠的成像面積，選擇protein gel，stain free gel，選擇曝光條件，激活45 s，成像。

1.3.3 牛乳清蛋白體外抗氧化活性的測(cè)定 以靈敏度最高的DPPH自由基清除能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)牛乳清蛋白的抗氧化活性。取樣品溶液2 ml加入等體積0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，避光放置30 min，酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定At。同法取2 ml蒸餾水加入等體積 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液測(cè)定吸光度記為A0。取2 ml樣品液加入2 ml乙醇混勻，在517 nm處測(cè)定吸光度為Ab，按照以下公式計(jì)算DPPH自由基清除能力：

表1 牛乳清蛋白干預(yù)衰老小鼠實(shí)驗(yàn)分組

式中：At為樣品溶液與DPPH乙醇溶液混勻所測(cè)得的吸光度值；A0為蒸餾水與DPPH乙醇溶液混勻所測(cè)得的吸光度值；Ab為樣品溶液與乙醇溶液混勻所測(cè)得的吸光度值

1.3.4 牛乳清蛋白體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1 衰老動(dòng)物模型制備。選25～30 g健康成年雌性昆明小鼠30只，頸背部皮下注射10%的D-半乳糖生理鹽水注射液0.25 ml/20 g，每日1次，連續(xù)42 d，制備衰老小鼠。

1.3.4.2 實(shí)驗(yàn)分組。牛乳清蛋白干預(yù)衰老小鼠實(shí)驗(yàn)分組（見表1）。

1.3.4.3 指標(biāo)檢測(cè)。乳清蛋白干預(yù)7 w后，檢測(cè)體重。小鼠斷頭采血，4℃靜置2 h，離心3 500 r/min，15 min。按說明書檢測(cè)血清中SOD和MDA。小鼠解剖分離胸腺，稱重。

式中：M1為胸腺重量；M2為小鼠體重

2 結(jié)果

2.1 牛乳清蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

乳清蛋白在SDS-PAGE中主要顯示出有4條主要的條帶，相對(duì)應(yīng)Marker主要分子量位于14.4～116KDa，從圖1中可以看出，4條主要的蛋白條帶分別為分子量為14.1 KDa的α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA），18 KDa的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG），免疫球蛋白（immunoglobulin，IgG）裂解的Ig-H（重鏈）和80KDa的乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）等。

圖1 牛乳清蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 牛乳清蛋白體外DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中的DPPH呈紫色，在517 nm處有最大光吸收，DPPH自由基清除反應(yīng)的程度取決于抗氧化劑的清除能力，由于該方法測(cè)定簡(jiǎn)單，所以廣泛應(yīng)用于自由基清除能力的測(cè)定。

圖2 牛乳清蛋白體外DPPH自由基清除能力測(cè)定圖

由圖2顯示，牛乳清蛋白對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而升高，在一定濃度內(nèi)呈量效關(guān)系。陽性組VC與BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力在0～4 mg/ml范圍內(nèi)明顯高于乳清蛋白，但在牛乳清蛋白4～6 mg/ml時(shí)乳清蛋白與陽性組的差別不大，尤其是乳清蛋白和BHT之間差別較小，當(dāng)濃度為4 mg/ml時(shí)，乳清蛋白的清除率為72.26%、BHT的清除率為78.87%、VC的清除率為87.81%；當(dāng)濃度為6 mg/ml時(shí)，乳清蛋白的清除率為79.51%、BHT的清除率為84.34%、VC的清除率為95.33%。

2.3 牛乳清蛋白對(duì)衰老小鼠體重的影響

由圖3可知，正常對(duì)照組、不同劑量牛乳清蛋白和VC干預(yù)衰老小鼠后，體重增長率與干預(yù)時(shí)間均呈正相關(guān)，且正常對(duì)照組增長率最高，牛乳清蛋白組和VC陽性對(duì)照組體重增長率相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與之相對(duì)應(yīng)僅衰老小鼠組體重增長率與干預(yù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，并與其他組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 不同劑量牛乳清蛋白干預(yù)衰老小鼠體重增長率的變化圖

2.4 牛乳清蛋白對(duì)衰老小鼠胸腺指數(shù)的影響

胸腺是動(dòng)物體內(nèi)重要的淋巴器官，具有重要的免疫作用，同時(shí)也是動(dòng)物體內(nèi)最先衰老的器官，從動(dòng)物體內(nèi)胸腺的比重可從側(cè)面看出動(dòng)物衰老的程度。由圖4顯示，不同劑量牛乳清蛋白和VC干預(yù)組衰老小鼠的胸腺指數(shù)與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而衰老組小鼠胸腺指數(shù)下降較大。說明牛乳清蛋白可以延緩衰老過程中免疫功能的降低。

圖4 不同劑量牛乳清蛋白干預(yù)衰老小鼠胸腺指數(shù)的變化圖

2.5 牛乳清蛋白干預(yù)衰老小鼠后，小鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物的變化

由圖5中結(jié)果可知，衰老組（NS）相比其他各組血清中MDA含量明顯增高，而SOD活力卻顯著下降，且均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。牛乳清蛋白低劑量組、VC陽性組和正常組相比血清中MDA含量、SOD活力相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而牛乳清蛋白高劑量組(CWPH)血清中MDA含量更低，SOD活力更高。說明牛乳清蛋白體內(nèi)具有較好的抗氧化活性，且高濃度組較VC陽性組抗氧化性更強(qiáng)。

圖5 不同劑量牛乳清蛋白干預(yù)衰老小鼠，小鼠血清中SOD活力和丙二醛（MDA）含量的變化圖

3 討論

3.1 牛乳清蛋白體外抗氧化性

DPPH自由基清除能力測(cè)定是最常用的體外抗氧化性評(píng)價(jià)方法。本實(shí)驗(yàn)以VC和BHT為陽性對(duì)照，梯度稀釋牛乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)在0.5～6 mg/ml范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力隨牛乳清蛋白濃度的增高而增強(qiáng)。這一結(jié)果與Ahmed S Gad[15]和Yong-Eun Kim[16]等研究結(jié)果相一致：WP體外抗氧化活性呈劑量依賴。

3.2 牛乳清蛋白體內(nèi)抗氧化性

機(jī)體細(xì)胞內(nèi)，新陳代謝過程會(huì)產(chǎn)生自由基，同時(shí)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)會(huì)有效地消除自由基。然而，由于自由基的過量產(chǎn)生，或抗氧化劑的消耗，體內(nèi)這種平衡被打破，細(xì)胞暴露于高水平的自由基壓力下，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致諸如脂質(zhì)過氧化、DNA鏈斷裂、氨基酸外消旋或脫羧、酶功能障礙和碳水化合物氧化分解[17]等細(xì)胞損傷。而持續(xù)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是衰老及其相關(guān)疾病[18-20]，癌癥[21,22]、心血管疾病[23,24]、糖尿病[25,26]等多種慢性疾病的致病因素。

抗氧化物活性物質(zhì)可以提高機(jī)體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH)的活性，降低丙二醛(MDA)的含量，從而抑制由此誘導(dǎo)的衰老[27]。WP 的β-乳球蛋白[28]不僅自身具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化的活性，而且在體內(nèi)可以水解成多種抗氧化肽段；另外，乳鐵蛋白能抑制由鐵誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸和丙二醛的生成；乳白蛋白、乳鐵蛋白等富含胱氨酸殘基，能通過消化道進(jìn)入細(xì)胞膜，還原成 GSH 的原料半胱氨酸，維持細(xì)胞和組織 GSH 水平，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[29]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)小鼠血清內(nèi)MDA的含量反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速度、強(qiáng)度和組織過氧化程度，SOD的活力反映出機(jī)體內(nèi)清除自由基的能力，也就是機(jī)體體內(nèi)抗氧化的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，衰老組小鼠MDA含量升高，SOD活性則降低，而添加牛乳清蛋白后與衰老組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果相反，且有顯著差異；牛乳清蛋白干預(yù)兩組與VC陽性對(duì)照組結(jié)果無顯著差異。證明牛乳清蛋白在體內(nèi)具有抗氧化活性，是一種天然、無害、營養(yǎng)價(jià)值高的抗氧化補(bǔ)充劑。

3.3 牛乳清蛋白對(duì)衰老小鼠免疫力的影響

大量研究顯示，乳清蛋白中的乳鐵蛋白和糖巨肽等成分均具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用[30]。胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，主要參與細(xì)胞免疫。胸腺指數(shù)可以在一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。本研究顯示，不同劑量牛乳清蛋白和VC干預(yù)組小鼠的胸腺指數(shù)與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而衰老組小鼠胸腺指數(shù)下降較大。說明牛乳清蛋白可以延緩衰老過程中免疫功能的降低。

綜上所述，該研究結(jié)果證明牛乳清蛋白和VC比較，體內(nèi)外抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用相仿，且在補(bǔ)充量為400 mg/kg時(shí)部分指標(biāo)優(yōu)于VC。表明牛乳清蛋白可以作為一種天然、無害、營養(yǎng)價(jià)值高的抗氧化補(bǔ)充劑，并延緩D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老。該研究為提高老年人群合理補(bǔ)充牛乳清蛋白，提高生活質(zhì)量提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。