Hela細胞裸鼠模型中腎臟VEGF的表達

郭麗娜，馮法銘，韓禹婷，張紹廣，王家敏，喬自林，楊 琨*

（1.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)簡稱VEGF，是具有高度特異性的促進血管內皮細胞生長的因子，有增強血管通透性、促進血管內皮細胞遷移增殖、增加細胞外基質變形和血管形成等作用。VEGF家族成員以結合抗體的方式來激活血管生成信號通路，調控血管內皮細胞遷移增殖、分化的相關生理正常和生理異常微環境。有三個主要促進血管生成的過程即血管發生、血管生成、動脈生成。VEGF對腫瘤血管結構的生成、維持和改建具有重要意義，為腫瘤細胞在生長微環境中增殖、浸潤和轉移提供有利條件[1]。與腫瘤的生長轉移有密切聯系。

科學研究表明，造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因是腫瘤轉移。一項研究表明，大約90%的癌癥死亡是由轉移形成引起的[2]。惡性腫瘤轉移過程包括從惡性腫瘤原發部位脫離侵入周圍的基質，進入淋巴管、體腔或血管，黏附在內皮細胞壁并遷徙到其他部位繼續生長，導致血管增生并形成與原發部位同樣類型的腫瘤。在腫瘤轉移過程中新血管的形成是腫瘤生長轉移和傳播的一種基本活動。

腎臟組織中，血管內皮生長因子主要由腎小管上皮細胞和腎小球足細胞產生，在抗間質纖維化，保證腎小管周圍毛細血管網結構與功能穩定，以及腎小球濾過膜結構完整等方面起到了非常重要的調控作用[3]。血行轉移在腫瘤轉移中占重要地位，腎臟作為泌尿器官，以腎小球毛細血管球過濾血液的形式生成尿液，此時血液中腫瘤特異性生長因子通過腎小球過濾作用可能留在腎臟中，進而形成轉移灶。

本實驗通過免疫組化染色方法定位分析血管內皮生長因子在腎臟中的表達來反應腫瘤的轉移情況，研究VEGF在Hela細胞注射裸鼠腎臟中的表達分布情況，為進一步揭示VEGF蛋白在裸鼠成瘤過程中的調節機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物用到免疫功能缺陷裸鼠：10只，4周齡雌性（BALB/c裸鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司）。

1.2 試劑與儀器

購于國家實驗細胞資源共享服務平臺的Hela細胞懸液；購于北京索萊寶科技有限公司的免疫組織化學檢測試劑盒（SP-0023）和DBA濃縮型顯色試劑盒，試驗所用一抗（兔VEGF多克隆抗體）及二抗（山羊抗兔）均購自北京博奧森技術有限公司。主要儀器有病理組織切片機、溫箱、組織攤烤片機、顯微鏡照相系統等。

1.3 免疫功能缺陷裸鼠異種移植Hela細胞動物模型的建立

Hela細胞連續傳代培養150代，建立并儲存于低溫保存介質中。通過皮下注射免疫缺陷裸鼠（BALB/c裸鼠）建立10只動物模型。裸鼠初始體重為16～19 g，接種數10只，皮下接種200 ml Hela細胞懸液，相當于1.0×107/ml活細胞，飼養時間60 d。

1.4 組織采集與固定

10只試驗裸鼠均成瘤，瘤體直徑超過1cm或者滿60 d即處死，并迅速進行病理解剖，收取瘤體，腎臟等組織器官樣本，及時放于4%多聚甲醛中固定12 h后更換固定液存放。

1.5 HE染色

組織固定好后，修割成1 cm3的小塊，進行包埋。使用病理組織切片機對包埋好后的石蠟塊進行切片，粗切厚度為20μm，細切厚度為5μm。將切好的組織于組織攤烤片機中展片，展片后用60℃烤片，烤至組織周圍石蠟融化即可進行染色，包括脫蠟、染色、脫水透明一系列步驟，最后使用中性樹脂進行封片。

1.6 免疫組化SP染色

石蠟切片（5 μm）烤片后脫蠟至水，蒸餾水和PBS（磷酸緩沖鹽溶液）分別浸泡5 min；經抗原修復（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復法）、阻斷、封閉后滴加一抗工作液孵育（37℃濕盒中）；隨后二抗（B液）、三抗（C液）反應后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察至顯色明顯立刻沖水停止反應；接著用蘇木精復染、鹽酸酒精分化、自來水沖洗反藍、脫水、透明、封片即可。其中，阻斷用液、封閉用液、二抗和三抗工作液來自免疫組化SP試劑盒；一抗來自兔GnRH多克隆抗體（工作濃度1：400）。

2 結果

2.1 Hela細胞接種裸鼠腎臟組織學觀察

由圖1A所示，在HE染色100倍的視野下腫瘤裸鼠腎臟組織結構完整，為腎臟被膜和實質的皮質部分。毛細血管充血。圖1B所示為HE染色200倍，可見視野中腎小體內含有大量血細胞，靜脈管中充盈著大量血液，腎小管管腔狹窄，呈淀粉樣變性且出現自溶現象。于腎間質中發現少量地從骨髓發育而來的B淋巴細胞，可能與腫瘤的生長、移植有關。

圖1 A和B為Hela細胞接種裸鼠腎臟組織HE染色圖片

2.2 Hela細胞接種裸鼠腎臟VEGF蛋白表達

由圖2C所示，免疫組化染色中所加兔VEGF多克隆抗體與腫瘤裸鼠腎臟中VEGF抗原結合呈棕黃色陽性反應，在腎臟皮質中VEGF蛋白主要于腎小管上皮細胞中的表達，腎小體中弱表達。圖D同部位200倍視野下可見腎小管管腔變窄，出現自溶現象。

圖2 C和D為Hela細胞接種裸鼠腎臟組織VEGF蛋白免疫組化染色

3 討論

本研究得出，HE染色下腫瘤裸鼠腎臟出現毛細血管充血，腎小管管腔狹窄、自溶及淀粉樣變性，病理變化可能與腫瘤的生長、轉移有關。免疫組化染色中，VEGF在Hela細胞腫瘤裸鼠模型腎臟的腎小管上皮細胞和腎小體中毛細血管球中均呈陽性表達，但在腎小管上皮細胞中呈強表達，腎小體毛細血管球次之。這是因為VEGF是腎臟血管形成的主要調節因子，并在腎小管上皮細胞和腎小球足細胞中廣泛表達[4]，但足細胞數量少于腎小管上皮細胞數量，因此視覺上腎小管上皮細胞血管內皮生長因子表達量強于腎小囊毛細血管球的血管內皮生長因子表達量。

研究表明，在動物生理異常或正常狀態下，血管通透性增加主要依賴于VEGF通過旁分泌方式來促進，將刺激因素對內皮細胞的刺激作用擴大，血漿蛋白的外滲得到促進，新生血管的臨時基質在此時形成，為新血管生成創造條件。在腫瘤中，VEGF及其受體高度表達。通過引起一系列信號傳導來刺激血管內皮細胞增殖，多種腫瘤血管新生的起始和延續中均有VEGF參與，以促進新血管和腫瘤的生長，與腫瘤新生血管的形成數目息息相關[5]。

VEGF家族的機制復雜，在體內的作用多種多樣，VEGF生物學功能活性包括：一是增加血管通透性：VEGF在引起血管通透性增加的物質中是作用最強烈的，血管通透性的增加為腫瘤細胞的生長以及新血管生成所需營養物質和血管支持物創造了有利的條件；二是刺激血管內皮細胞分裂、重建和增殖；三是抑制腫瘤細胞的凋亡；四是促進形成血管外臨時基質。因其在腫瘤生長、轉移過程中具有重要意義可以作為早期腫瘤檢測指標之一。目前用于治療腫瘤的靶向藥物包含VEGF信號通路抑制劑，如可溶性VEGF-C、VEGFR-3和VEGF-3的中和抗體[1]。雖然VEGF信號通路抑制劑治療腫瘤取得良好效果，但VEGF的上游基因是否調節和控制VEGF的表達，以及腫瘤淋巴管、血管生成是否有VEGF對其下游基因表達影響的原因仍不完全清楚，有待進一步驗證。