PCR檢測不同樣品中牛羊布魯氏菌病的對比試驗研究

王 佳,關紅民,豆思遠

（1.甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅畜牧工程職業技術學院，甘肅 武威 733006）

布魯氏菌病（Brucellosis）簡稱布病，是由布魯氏桿菌侵入動物機體引起的慢性細菌性人獸共患傳染病，世界動物衛生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物傳染疫病[1]。該病主要侵害動物機體的生殖器官，嚴重影響畜牧業發展和食品衛生安全，危害人類健康，阻礙對外貿易[2]。布魯氏菌病是當前一種嚴重威脅公共衛生事業和畜牧業發展的人獸共患傳染性疾病[3]。常用的布魯氏菌病病原學檢測方法中，PCR檢測是一項技術成熟、時間短的快速檢測方法，但PCR檢測方法與檢測試劑所要求的樣品以組織樣為主，采集過程存在人員感染和環境污染的風險[4，5]。鑒于此，本研究通過對不同樣品中牛羊布魯式菌病的分析研究，旨在篩選出檢測結果準確、可操作性強，可替代組織和血液的樣品，以期降低牛羊布魯氏菌病采樣、檢測和廢棄物處理中人員的感染風險，為準確檢測牛羊布魯氏菌病的感染情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及數量

樣品采自29頭牛、18只羊。采集組織樣品15份，奶牛11份、羊4份。奶牛鼻腔拭子20份、生殖道拭子12份，羊鼻腔拭子8份、生殖道拭子16份，拭子樣品共計56份。鼻腔拭子、生殖道拭子分別用PBS和0.5%石碳酸生理鹽水緩沖溶液保存。采集尿液42份，奶牛29份、母羊13份。各種樣品采集數量詳見表1。

1.2 試劑

布魯氏菌病PCR試劑盒購自北京世紀元亨生物制品有限公司，批號為：201301G25。PBS溶液實驗室自制，濃度為0.01 mol/L，pH值為7.4。

1.3 樣品制備

組織和分泌物加PBS液1 ml，研磨處理后取上清液100 μl，拭子樣品取PBS浸液和0.5%石碳酸生理鹽水浸液各100 μl，加入200 μl消化液和和20 μl蛋白酶K，震蕩混勻后，置于56℃水浴消化1 h。

表1 奶牛和羊PCR檢測樣品數量（單位：份）

表2 PCR檢測不同樣品中奶牛和羊布魯氏菌病測定結果

表3 PCR檢測不同類型樣品測定結果

1.4 DNA提取（濾膜法）

1.4.1 從水浴鍋中取出樣品降至室溫，加入300 μl的DNA結合液混勻，將全部液體移入吸附柱中，室溫靜置3 min，10 000 rpm離心30 s。

1.4.2 棄去收集管中液體，加入500 μl DNA洗滌液，10 000 rpm離心30 s。

1.4.3 重復上一步。

1.4.4 棄去收集管中液體，10 000 rpm空柱離心1min，除去殘留DNA洗滌液。

1.4.5 將吸附柱放入新的1.5 ml離心管中，50 μl洗脫液洗脫模板。

1.5 擴增條件

擴增體系每份總體積為20μl，含16μl的PCR反應液、2μl的Taq DNA聚合酶、2μl模板DNA。擴增條件：94℃用時3 min；循環94℃用時30 s，60℃用時30 s，72℃用時30 s，共35次；72℃延伸7 min。

2 結果與分析

2.1 組織中牛羊布魯氏菌病檢測結果

由表2、表3可知，檢測組織樣品15份，奶牛陽性數為10份，羊陽性數為3份，奶牛布魯氏菌病感染率為90.91%，羊布魯氏菌病感染率為75.00%，組織樣品中牛羊布魯氏菌病的平均感染率為86.67%。

2.2 鼻腔拭子中牛羊布魯氏菌病檢測結果

從表2、表3、圖1、圖2可知，PBS保存的鼻腔拭子樣品15份，檢出陽性11份，奶牛布魯氏菌病感染率為72.73%，羊布魯氏菌病感染率為75.00%。PBS保存的鼻腔拭子布魯氏菌病的平均感染率為73.33%；0.5%石碳酸生理鹽水保存鼻腔拭子13份，檢出陽性10份，奶牛布魯氏菌病感染率為77.78%，羊布魯氏菌病感染率為78.00%，0.5%石碳酸生理鹽水保存的鼻腔拭子布魯氏菌病的平均感染率為76.92%。鼻腔棉拭子中牛羊布魯氏菌病的平均感染率為75%。

圖1 牛鼻腔拭子中布魯氏菌病PCR擴增結果（部分樣品）

圖2 羊鼻腔拭子中布魯氏菌病PCR擴增結果

2.3 生殖道拭子中牛羊布魯氏菌病檢測結果

由表2、表3、圖3、圖4可知，PBS保存的生殖道拭子15份，檢出陽性12份，奶牛布魯氏菌病感染率為85.71%，羊布魯氏菌病感染率為75.00%，PBS保存的生殖道拭子布魯氏菌病的平均感染率為80.00%；0.5%石碳酸生理鹽水保存生殖道拭子13份，檢出陽性11份，奶牛布魯氏菌病感染率為80.00%，羊布魯氏菌病感染率為87.50%，0.5%石碳酸生理鹽水保存的生殖道拭子布魯氏菌病的平均感染率為84.62%。生殖道棉拭子中牛羊布魯氏菌病平均感染率為82.14%。

2.4 尿液中牛羊布魯氏菌病檢測結果

從表1、表2、圖4可知，檢測奶牛尿液29份，檢測出陽性21份，感染率為72.41%；檢測母羊尿液13份，檢測出陽性10份，感染率為76.92%。

3 討論

試驗研究表明，牛羊的組織、鼻腔拭子、生殖道拭子及尿液中均可檢測出布魯氏菌。在組織樣品中，奶牛布魯氏菌病的感染率高于羊。用0.5%石碳酸生理鹽水保存的鼻腔拭子，奶牛和羊布魯氏菌病的感染率均高于PBS保存的拭子。用PBS保存的生殖道拭子，奶牛布魯氏菌病的感染率高于石碳酸生理鹽水保存的拭子，兩種保護液中的羊生殖道拭子，布魯氏菌病的感染情況與奶牛相反。用同種保護液保存的牛羊鼻腔拭子和生殖道拭子，生殖道拭子的感染率高于鼻腔拭子。用兩種保護液保存的牛羊同種拭子，0.5%石碳酸生理鹽水保存的拭子感染率高于PBS。尿液中，母羊布魯氏菌病的感染率高于奶牛。

圖3 牛生殖道拭子中布魯氏菌病PCR擴增結果（部分樣品）

圖4 羊尿液、牛生殖道拭子中布魯氏菌病PCR擴增結果（部分樣品）

通過檢測分析不同樣品中牛羊布魯氏菌病的感染情況可知，樣品檢出率從高到低順序為組織樣品、生殖道拭子、鼻腔拭子、尿液。采用PCR方法檢測鼻腔拭子和生殖道拭子，拭子樣品保存在0.5%石碳酸生理鹽水中，可降低采集組織樣品和血液樣品造成人員感染牛羊布魯氏菌病的生物安全威脅，提高牛羊布魯氏菌檢測的準確性。