一起甘肅高山細毛羔羊大腸桿菌病的實驗室診斷與防治

佘海瑞，賀雪麗

（1.甘肅省肅南裕固族自治縣康樂鎮農牧技術服務站，甘肅 肅南 734400；2.甘肅省肅南裕固族自治縣動物疫病預防控制中心，甘肅 肅南 734400）

1 發病情況

肅南縣康樂鎮賽鼎村張某飼養高山細毛羊185只，截至2020年4月15日產羔80只，4月8日開始羔羊發病，發病羔羊年齡段不一（3～20日齡），且均為膘好母羊所產的體格大強健羔羊，到4月15日，發病31只，死亡20只。

2 臨床癥狀

病初體溫升高到42℃，精神委頓，結膜潮紅，呼吸困難，四肢僵硬，運步失調或跛行繼而臥地不起，食欲不振、發抖，口流清涎。未經治療的病羔羊多數在發病后24 h內死亡。經治療的病羔羊跛行稍好轉，停藥即復發，2～3 d治療無效死亡。

3 剖檢變化

肝臟及膽囊腫大，肝呈黑紫色，腎臟有出血點，質地無明顯變化。腹水增多，并具有惡臭味，其他器官無病變。

4 實驗室診斷

4.1 涂片觀察

剪取肝、腎、淋巴結組織樣品和腸內容物做涂片，然后對涂片進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察。

4.2 細菌分離及鑒別培養

將肝、脾、肺、腎組織，在生物安全柜內表面消毒（過火焰）、十字切口后從內部組織剪取約1 g（黃豆大?。┙M織分別直接接種在TSA 培養基和血瓊脂培養基上，倒置于37℃恒溫培養箱中培養18 h，觀察結果，并進行細菌純化。將分離、純化的待檢菌分別接種麥康凱瓊脂, SS瓊脂上，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h，觀察結果。

4.3 藥敏實驗

挑取單菌落接種于4.5 mlTSB培養基中，37℃培養16 h。用無菌生理鹽水將培養好的菌液做1：20稀釋，制成均勻懸液。經與濁度管（0.5 麥氏單位比濁管）比較，濁度一致。取100 ul稀釋過的菌液用涂菌棒均勻地涂于TSA培養基表面。平板放置于37℃ 3～5 min 后，用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于一平板表面，并輕壓一下紙片，使其貼平。每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。孵育：貼好紙片后在15 min 內放到37℃孵育箱，將平板倒置培養。平板孵育16～18 h后取出。

培養后取出平板，抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。用游標卡尺量取抑菌圈的直徑，并判定試驗結果。

4.4 實驗動物攻毒試驗

挑取單菌落接種于4.5 ml TSB 培養基中，37℃ 培養16 h。取0.2 ml/只，腹腔注射3只普通級昆明小鼠，另用3只作為對照，注射0.2 ml的TSB培養基。觀察并記錄小鼠的臨床表現及死亡情況。

4.5 PCR產物測序，BLAST 分析

用細菌基因組DNA 提取試劑盒DNA，細菌16 SRNA通用引物進行擴增、電泳后，經凝膠成像系統成像，觀察結果后直接用PCR產物送公司測序，BLAST 分析。

用大腸桿菌特異性引物uidAF/uidAR對上述樣品DNA再次進行PCR檢測。

4.6 實驗室診斷結果

4.6.1 涂片觀察 從肝、腎、淋巴結、腸內容物涂片中明顯觀察到菌體（見圖1），初步判定為大腸桿菌。

圖1 組織涂片革蘭氏染色（100倍）

4.6.2 培養菌落形態及特性 其中使用肝、脾、肺組織劃線的培養基有菌落生長，其余組織無菌落生長。TSA 培養基平板上形成隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的灰白色菌落；血瓊脂平板上不溶血；SS 瓊脂、麥康凱瓊脂上形成粉紅色菌落。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢可見中等大小的革蘭氏陰性球桿菌, 兩端鈍圓。

4.6.3 藥敏試驗 藥敏試驗結果見表1。

表1 藥敏試驗

4.6.4 動物攻毒試驗結果 在注射18 h后3只實驗組小鼠全部死亡，對照組無反應。無菌采取死亡小鼠肝臟進行細菌分離培養鑒定, 分離出與病原菌一致的細菌。

4.6.5 PCR產物測序及BLAST 分析 結果見圖2。

圖2 BLAST分析結果為大腸埃希氏菌

4.6.6 大腸桿菌桿菌特異性引物PCR檢測 結果（見圖3）。

圖3 PCR結果圖

4.6.7 實驗室診斷結論 分離的培養物經菌落、菌體形態觀察、藥敏試驗、動物攻毒試驗和PCR產物送公司測序后BLAST 分析、大腸桿菌桿菌特異性引物PCR檢測，確診為致病性大腸桿菌。

5 防治

5.1 預防措施

5.1.1 注意羊圈、環境及用具的消毒 每年的產羔前兩周至產羔結束，期間要每隔一周進行徹底消毒。地面、墻面噴霧消毒后密閉，熏蒸消毒。產羔期及時進行圈舍及環境中的胎衣的清理工作，每天噴霧消毒1次，消毒藥物替換使用。常用消毒藥物如強力消毒靈、84消毒劑等。

5.1.2 加強懷孕母羊飼養管理 注意補飼，采用全價飼料和多種飼草飼喂，避免營養缺乏。

5.1.3 搞好初生羔羊的護理 注意保暖，保證吃到初乳，對剛出生的羔羊及時扎臍并用5%碘酊進行臍帶浸泡消毒。

5.1.4 對新生羔羊全部進行藥物預防 在羔羊出生1～2d內用土霉素片粉或多西環素2 g 用適量煉制豬油(約1 cm3)拌勻后，吞服，每天1次，連用3d，或用慶大霉素在羔羊出生1 d后2ml進行灌服，連用3 d。

5.2 治療措施

5.2.1 及時隔離病羔，加強圈舍及環境的衛生清理和消毒，對病死羔羊采取嚴格的無害化處理措施。

5.2.2 對病羔羊進行藥物治療：頭孢曲松或頭孢噻肟0.1g配用注射用水肌注，每天1次，連用3 d。對有關節癥狀或發熱嚴重者的用頭孢曲松或頭孢噻肟0.1g配用2 ml地塞米松磷酸鈉、安痛定3 ml肌注。

5.2.3 加強飼養管理，懷孕母羊和產羔母羊及時分群。

5.2.4 對羔羊進行全群藥物預防，按5.1.4辦法進行，可適當加大預防劑量。

5.2.5 母羊產羔后及時用0.1%的高錳酸鉀水擦拭母羊的乳房、乳頭和腹下。

6 討論

大腸桿菌菌為條件性致病菌，本病的發生與當地的氣候條件和飼養管理有一定的關系。當地甘肅高山細毛母羊每年10月底配種，來年3月底開始產羔，母羊懷孕的大部分時期及產羔期是枯草期，當地氣候條件寒冷，母羊懷孕和產羔期氣候寒冷多變，傳統的放養方式中母羊人工補飼時間短，且飼草品種單一，導致母羊營養缺乏，加之氣候多變使羔羊的抵抗力降低是該病發生的重要誘因。

對母羊或羔羊使用疫苗來預防該病，筆者并不贊同使用疫苗，首先是大腸桿菌血清型多，其次是羔羊往往還來不及產生抗體就已經發病死亡。所以對于該病的預防重在飼養管理。