秋水仙素對菊苣多倍體的誘導

趙建華 任國輝 鄭金雙

摘要：利用不同質量濃度秋水仙素溶液對菊苣生長點進行不同次數的誘變處理。通過觀察氣孔特征、測定DNA相對含量進行誘變植株篩選鑒定，確定其倍性水平。結果表明，0.2%秋水仙素處理4次，菊苣誘導率最高，為8.16%，獲得8株菊苣同源四倍體植株，與二倍體對照相比，變異植株葉片增厚，葉色加深，葉片褶皺，下表皮氣孔變大，保衛細胞內葉綠體數量增加，葉綠素含量增加，單位面積氣孔數目減少。本試驗共獲得23株變異植株，其中22株同源四倍體，1株混倍體，構建了菊苣多倍體誘導技術體系，獲得了菊苣多倍體新種質，豐富了菊苣遺傳基礎，為良種選育提供了材料。

關鍵詞：菊苣;秋水仙素;誘導;同源四倍體

中圖分類號：S567.23+9.035.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0177-06

菊苣（Cichorium intybus L.）為菊科菊苣屬多年生草本植物，營養價值高，抗逆性強。以干燥地上部分及根入藥，味微苦、咸，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等功效[1]。菊苣葉片柔嫩多汁，營養物質豐富，研究表明，其葉叢期含粗蛋白22.87%，初花期含粗蛋白14.73%、粗脂肪2.1%、粗纖維30.6%，被稱為綠色健康之王[2]。目前，國內關于菊苣的研究多集中于栽培技術[3-4]、活性成分測定及提取物的藥理作用[5-6]等方面，而對于菊苣遺傳育種方面的研究較少，張玉等利用60CO-r輻照菊苣種子發現，高劑量輻照對菊苣誘變效果明顯[7]，但誘變是正向還是逆向則需進一步在農藝性狀方面作深入研究。

多倍體植物大多表現為營養器官的“巨大性”，具有生長健壯、抗逆性增強、果實增大以及營養物質含量提高等優點，因此多倍體誘變育種已成為植物育種的重要方式，目前已在大田作物、蔬菜作物、觀賞植物、藥用植物育種方面得到廣泛應用。隗志松等研究發現，多倍體水稻植株高大粗壯，穗大粒大，稻米質優，抗逆性強[8]。茆吉健利用秋水仙素誘變處理獲得四倍體蘿卜，產量較二倍體增加26.92%，并且根內可溶性蛋白和可溶性糖等營養成分較二倍體植株顯著增加[9]。宋蓮等利用秋水仙素對墨蘭×大花蕙蘭的F1進行誘變處理，獲得的多倍體植株觀賞價值高和抗逆性強[10]。王鳳寶等采用秋水仙素浸泡枸杞干種子，獲得了對癭螨免疫，高抗白粉病和根腐病，營養品質和藥用成分（甜菜堿、枸杞多糖、黃酮類）顯著高于二倍體對照的多倍體新種質[11]。

本試驗采用不同質量濃度的秋水仙素溶液對子葉期菊苣進行不同次數的誘變處理，以期構建菊苣多倍體誘導技術新體系，豐富菊苣種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菊苣（Cichorium intybus L.）種子，購于承德興春和農業集團股份有限公司。

1.2 試驗方法

本試驗采用隨機區組設計，2因素（不同秋水仙素濃度）3水平（不同處理次數）處理。

第1次誘變處理于2017年10月初進行。將菊苣種子直播于50孔育苗穴盤中，置于棚中育苗，待菊苣2張子葉完全展開后，將棉球置于兩子葉中間的生長點處，利用不同質量濃度秋水仙素（0.05%、0.10%、0.20%）分別于06：00—07：00和17：00—18：00處理3、5、7次。以蒸餾水處理為對照，每個處理50株，2次重復，待所有處理結束后，摘去棉球，繼續育苗。

第2次誘變處理于2018年3月中旬，第3次于10月初在智能日光溫室中進行試驗。處理方法同第1次處理，利用0.1%和0.2%秋水仙素溶液分別處理不同次數（4、6、8次），每個處理50株，3次重復。

1.3 多倍體植株的篩選與鑒定

1.3.1 氣孔鑒定 當植株有完全展開的3張葉時，取二倍體和誘變植株完全展開的葉片，用鑷子撕取下表皮，置于滴有1滴蒸餾水的載玻片上，蓋片，趕出氣泡，吸去多余水，于Olympus BX53光學顯微鏡下觀察，20×鏡下選取10個視野，觀察氣孔大小、單位面積氣孔數目并記錄，篩選氣孔變異的植株為候選植株。

氣孔變異植株比例=氣孔鑒定變異株數/處理株數×100%。

1.3.2 DNA相對含量鑒定 利用流式細胞儀鑒定氣孔以獲得候選植株進行NDA相對含量鑒定，剪取二倍體和誘變植株完全展開的幼嫩葉片，放入裝有500 μL裂解液的預冷培養皿中，刀片快速切碎，用260～560目的尼龍網過濾到離心管中，放置于冰中 5 min，加入100 μL PI染色液，于冰上避光染色 12 min，染色后移至上樣管中，利用BD LSR FortessaTM流式細胞儀檢測，確定其倍性水平，并對獲得的變異植株編號，T表示同源四倍體（T-1至 T-22），H表示混倍體（H-1）。

根據秋水仙素處理后成活株數計算致死率，依據上述鑒定方法獲得的變異株數計算誘導率。

致死率=死亡株數/處理幼苗總數×100%;

誘導率=變異株數/處理幼苗總數×100%

1.4 二倍體與變異植株的比較

1.4.1 葉片大小及厚度的測量 在植株有5張完全展開葉時，取二倍體與變異植株的完全展開葉，用直尺測量葉長和葉寬，再利用打孔器取中葉脈兩側的葉片，用游標卡尺測量10張小葉片的厚度。

1.4.2 氣孔大小的比較 取二倍體和變異植株完全展開的葉片，利用氣孔鑒定的制片方法，在顯微鏡下觀察，40×鏡下選取5個視野，測量氣孔的長和寬，記錄氣孔保衛細胞中葉綠體數目。

1.4.3 葉綠素含量測定 稱取0.2 g成熟葉片放入研缽中，加入95%乙醇研成勻漿，移至10 mL容量瓶中定容，3 000 r/min離心5 min，取上清液，加95%乙醇稀釋，利用分光光度計于662、644 nm下比色，記錄吸光度D值并計算葉綠素含量。

葉綠素含量（mg/L）=5.13×D662 nm+20.44×D644 nm;葉綠素相對含量（mg/g）=葉綠素濃度（mg/L）×葉綠素溶液體積（mL）/葉片質量（g）×1 000。

2.5 數據分析

利用Excel表格和DPS軟件進行數據整理分析。

3 結果與分析

3.1 秋水仙素誘導條件篩選

由表1可知，在第1次誘變中，植株變異率最高為31.00%（0.20%秋水仙素處理7次），最低為13.00%（0.05%秋水仙素處理3次）。由于棚中高溫低濕的條件不利于幼苗生長，導致幼苗死亡率極高，隨著秋水仙素濃度的增加，致死率逐漸升高，0.20%秋水仙素處理7次致死率最高，為100%，0.05%秋水仙素處理3次致死率最低，為87.00%。經比較發現，0.05%秋水仙素處理生長點后植株形態變異數量最少;不同質量濃度處理3次時，植株形態變異數量均少于其他處理次數。因此，秋水仙素濃度為0.05%，處理次數為3次時，均不適合作為秋水仙素誘導菊苣多倍體的處理條件。

與第1次誘變處理相比發現，第2次誘變處理的植株形態變異的株數較多，變異率增加。形態鑒定結果表明，0.20%秋水仙素處理8次，變異率最高，為49.67%，0.10%秋水仙素處理4次，變異率最低，為35.33%。0.20%秋水仙素處理6次、8次致死率最高，均為31.67%;0.10%秋水仙素處理4次致死率最低，為13.67%。DNA相對含量鑒定共獲得16株變異植株，誘導率最高為5.33%（0.20%秋水仙素處理4次），誘導率最低為1.67%（0.10%秋水仙素處理6次、0.20%秋水仙素處理8次）。移栽至智能日光溫室后，高溫低濕的條件導致病蟲害發生嚴重，變異植株死亡率極高。

3.2 秋水仙素對菊苣誘變效果的影響

由表2可知，不同質量濃度的秋水仙素和不同次數處理之間相比較，隨著濃度和處理次數的增加，誘導率和致死率均呈增加趨勢。氣孔鑒定的結果表明，0.2%秋水仙素處理4次和6次變異率較高，分別為8.00%和6.67%，與其他處理相比差異顯著。0.1%秋水仙素處理6次致死率最低，為1.00%;0.2%秋水仙素處理8次致死率最高，為10.26%。DNA相對含量鑒定結果表明，0.2%秋水仙素處理4次和6次誘導率較高，分別為8.16%（8株）和7.14%（7株），與其他處理相比差異顯著;0.1%秋水仙素處理4次誘導率最低，為0.99%（1株）。

利用流式細胞儀對不同倍性的菊苣進行鑒定（圖1），橫軸為熒光強度值，縱坐標為細胞核數量，不同倍性菊苣的熒光強度峰值不同。二倍體熒光強度值為50時，細胞核數量達到最大值;四倍體熒光強度值為100時，細胞核數量達到最大值;混倍體在熒光強度值為50和100時，均出現峰值。

3.3 二倍體與多倍體菊苣的比較

3.3.1 葉片特征、氣孔特征及葉綠素含量比較 變異植株的葉色加深，葉片褶皺（圖2-A）;四倍體氣孔增大，單位面積氣孔數目減少，混倍體氣孔大小不一（圖2-B、圖2-C、圖2-D）。由表3可知，變異植株的葉長和葉寬均顯著低于二倍體植株。所有四倍體植株的葉厚均大于二倍體植株，其中 T-1、T-2、T-5、T-6、T-7、T-13、T-19、T-20和H-1與對照相比差異不顯著。所有變異植株的葉綠素含量均顯著高于二倍體植株，不同變異植株間葉綠素含量差異較大，其中T-6、T-7、T-10、T-12、T-16和 H-1葉綠素含量較高。

3.3.2 菊苣氣孔大小、單位面積氣孔數目及葉綠體數目的比較 由表4可知，變異植株（除F5、H-1）的氣孔長度顯著大于二倍體植株，其中T-5與二倍體差異不顯著;變異植株氣孔寬度均小于二倍體植株，其中T-22與二倍體差異不顯著。變異植株葉片下表皮單位面積氣孔數目與二倍體相比減少19.78%～88.39%，與二倍體植株存在顯著差異。四倍體植株葉片下表皮保衛細胞內葉綠體數目顯著的多于二倍體植株，增加了12.05%～32.53%，但混倍體植株與二倍體植株差異不顯著。

變異植株之間單位面積氣孔數目差異不顯著，其中T-10、T-14、T-17、T-18、T-20、T-21和H-1的單位面積氣孔數目;T-2和T-3單位面積氣孔數目較多。

4 結論與討論

秋水仙素是人工誘導植物多倍體常用的藥劑，在細胞有絲分裂期間通過抑制紡錘體的形成從而實現染色體的數目加倍[12-13]，但高濃度的秋水仙素可以致使材料的生長受到抑制或死亡。殷婷婷利用不同濃度秋水仙素和通過不同處理時間以誘導油菜種子，發現0.4%秋水仙素處理48 h時死亡率最高為63%[14]。彭綠春等利用不同濃度秋水仙素和不同時間浸泡腋花杜鵑無菌苗，發現秋水仙素濃度為0.25%處理72 h死亡率最高為60%[15]。孫嘉曼等采用不同濃度秋水仙素對野生蕉愈傷組織進行不同時間誘變處理，以0.2%濃度處理15 d時致死率最高，為43.62%[16]。本試驗發現秋水仙素濃度越高，處理次數越多，幼苗致死率越高，其中0.2%秋水仙素處理8次時，致死率最高，為10.26%。

篩選最佳的秋水仙素濃度和處理時間，是獲得多倍體植物的關鍵因素。孔維一等采用秋水仙素處理一串紅幼苗莖尖，發現0.1%秋水仙素處理2 d時誘變率最高，為13.3%[17]。吳照云等利用秋水仙素處理胭脂蘿卜幼苗生長點，表明以2 g/L秋水仙素誘變率最大，為33.3%[18]。鄧云等采用秋水仙素處理二倍體不結球白菜，表明以0.1 mol/L秋水仙素處理6次效果最好，誘導率達17.5%[19]。本研究以不同質量濃度秋水仙素處理不同次數來誘導菊苣幼苗生長點，結果表明，0.2%秋水仙素處理4次菊苣誘變效果最好，誘導率為8.16%。

同源四倍體植株葉片厚度、氣孔大小、葉綠素含量、保衛細胞內葉綠體數均高于二倍體植株，而氣孔密度低于二倍體植株[20]。漆慧娟比較不同倍性的甜葉菊發現，四倍體植株氣孔密度比二倍體減少49.16%，保衛細胞內葉綠體數較二倍體增多78.49%，氣孔長和寬比二倍體分別增加72.25%和69.25%，葉綠素含量也顯著高于二倍體[21]。鐘程等比較不同倍性水平貴州野生淡黃花百合，發現四倍體植株氣孔比二倍體明顯增大，單位面積氣孔數目減少，且氣孔長寬及單位面積氣孔數均達到極顯著水平[22]。吳順等比較不同倍性水平的紫花丹參，發現多倍體葉綠素含量比二倍體提高近75%[23]。本研究中，菊苣變異植株葉片下表皮單位面積氣孔數較二倍體減少11.61%～55.22%，葉綠素含量比二倍體提高近23.46%，四倍體保衛細胞內葉綠體數較二倍體增加84.56%，葉片厚度及氣孔大小均與二倍體存在顯著差異。

本試驗得到的變異植株，其葉長和葉寬顯著低于二倍體，其原因可能是秋水仙素的毒害作用，使菊苣F1植株生長緩慢，葉片褶皺，葉面積減小，若收獲四倍體植株的種子后繼續種植，其葉面積可能增大。

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