急性白血病KG1a細(xì)胞抗原對外周血單個核細(xì)胞殺傷活性和T細(xì)胞受體VαβT細(xì)胞增殖的影響

王國征 肖瀚 吳遠(yuǎn)彬 郭坤元 代喜平

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（廣東省中醫(yī)院）血液科（廣州510120）

急性白血病（acute leukemia）是人類常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害健康[1-2]，盡管隨著臨床新藥的發(fā)展和移植預(yù)處理方案優(yōu)化及抗排斥技術(shù)的進(jìn)步[3-4]，但在復(fù)發(fā)/難治白血病仍療效欠佳[5-6]。其根本原因是微小殘留病的存在[7-8]，最大限度清除微小殘留，延長緩解期、提高治愈率是個亟待解決的問題。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，受抗原刺激后能形成特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），在抗腫瘤免疫中起重要作用，是過繼性免疫治療和異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GVL）主要效應(yīng)細(xì)胞[9-10]。本研究應(yīng)用制備的急性白血病細(xì)胞KG1a 抗原和外周血單個核細(xì)胞（PBMC）混合培養(yǎng)，分析誘導(dǎo)前后PBMC 殺傷KG1a細(xì)胞活性的變化，同時應(yīng)用基因掃描技術(shù)分析T細(xì)胞受體Vαβ譜系的表達(dá)情況，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞系、試劑和儀器急性髓系白血病KG1a細(xì)胞系由本實驗室傳代保存；PRMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青），淋巴細(xì)胞分離液（廣州威佳科技有限公司），乳酸脫氫酶（LDH）殺傷活性試劑盒（美國Promega公司），異丙醇、DEPC、氯仿、70%乙醇、無水乙醇、DEPCH2O、溴化乙錠、瓊脂糖凝膠（西班牙Biowest公司），Trizol 試劑（Invitroge公司），cDNA 合成和PCR 擴(kuò)增試劑（MBI，F(xiàn)ermentas），DNA marker（上海生工公司），10×Loading Buffer（大連TaKaRa）。6%聚丙酰胺凝膠、去變性膠上樣緩沖液、離子甲酰胺（美國Sigma公司），GeneScan-500-TAMRA（500 ROX）標(biāo)準(zhǔn)品（美國Applied Biosystems-ABI公司），絲裂霉素C（MMC，山東齊魯制藥廠）。Eppendorf 高速低溫離心機(jī)、精密加樣槍、Biophotometer 核酸蛋白分析儀（美國Fisher Scientific公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），一次性培養(yǎng)瓶、試管、培養(yǎng)板（美國Corning公司），電泳槽（北京海天友誠有限公司），UVI 凝膠成像系統(tǒng)（德國BioRad公司），血球計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司），9700PCR 擴(kuò)增儀（美國PE公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)37℃水浴箱中溶解凍存的KG1a細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）4 mL 重新懸浮細(xì)胞，接種于一次性培養(yǎng)瓶（25 cm2），置于CO2培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 KG1a細(xì)胞抗原的制備無菌試管收集對數(shù)生長的KG1a細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/L的絲裂霉素C（Mitomycin C，MMC），37℃水浴孵育30 min，用體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整至1×106/mL以備用。

1.4 KG1a細(xì)胞抗原和單個核細(xì)胞混合培養(yǎng)采用密度梯度離心法分離4例健康人外周血中單個核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。取絲裂霉素C 處理的KG1a細(xì)胞3 mL和1 mL 制備好的單個核細(xì)胞（PBMC）接種于6孔板行細(xì)胞混合培養(yǎng)，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，隔日半量換培養(yǎng)液，觀察生長情況。

1.5 KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PBMC的殺傷活性測定以混合培養(yǎng)前后單個核細(xì)胞（PBMC）效應(yīng)細(xì)胞，以KG1a細(xì)胞為靶細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，加入96孔板中，每孔50 μL。效靶組：按不同效靶比（5∶1、10∶1、20∶1）分別加入不同量的PBMC細(xì)胞各50 μL；效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組：PBMC細(xì)胞50 μL，RPMI-1640 培養(yǎng)基50 μL；靶細(xì)胞自發(fā)釋放組：靶細(xì)胞50 μL，RPMI-1640 培養(yǎng)基50 μL；靶細(xì)胞最大釋放組：10 μL 裂解液、50 μL靶細(xì)胞，RPMI-1640 培養(yǎng)基50 μL；空白對照組：100 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液。各組均設(shè)4個復(fù)孔，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h后，1 000 r/min 離心5 min，小心吸取50 μL 上清液加入96 孔酶標(biāo)板中，每孔加入LDH 底物反應(yīng)液50 μL，室溫下靜置30 min，每孔再加入反應(yīng)終止液50 μL。酶標(biāo)儀測波長490 nm 處光密度（optical density，OD）值。計算PBMC細(xì)胞殺傷活性。殺傷率=（靶細(xì)胞平均OD值-靶細(xì)胞自然釋放組平均OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組平均OD值）（/靶細(xì)胞最大釋放組平均OD值-靶細(xì)胞自然釋放組平均OD值）×100%。

1.6 流式檢測KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PBMC中T細(xì)胞表型變化收集KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PBMC細(xì)胞到離心管，1 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，2 mL PBS洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。每管加107/mL 細(xì)胞懸液1 mL，按1 μg/106個細(xì)胞濃度分別加入CD3、CD4和CD3、CD8 單抗，4℃標(biāo)記30 min。PBS 500 μL洗滌，1 500 r/min離心5 min，共2次。吹勻細(xì)胞，加入300 μL PBS 上機(jī)分析。

1.7 KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PCR擴(kuò)增TCRVαβ家族CDR3 基因片段 4例經(jīng)KG1a 抗原刺激前后的PBMC的總RNA采用Trizol一步法提取，cDNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成。取出cDNA 產(chǎn)物-20℃保存。以RT-PCR檢測β-actin 基因確定cDNA的質(zhì)量。總反應(yīng)體系25 μL，含25 mmol/L MgCl21.5 μL、10×Buffer 2.5 μL、2 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL、40 U/μL Taq DNA 聚合酶1.25 U、cDNA 模板1 μL、12.5 μmol/L 特異性上游引物1 μL、12.5 μmol/L 公共下游引物1 μL、ddH2O 15 μL。TCR Vα擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。TCR Vβ擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)。72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性者作Genescan分析。

1.8 GeneScan基因掃描分析T細(xì)胞克隆變化取96孔板，每孔分別加入2 μL 去離子甲酰胺，0.5 μL GeneScan-500-TAMRA，0.5 μL 變性膠上樣緩沖液（25 mmol/L EDTA，50 mg/mL blue dextran）；另取TCR Vα和Vβ各家族熒光標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物各2 μL，分別加入Genescan25002TAMRA 0.5 μL、變性膠上樣緩沖液0.5 μL、去離子甲酰胺2 μL。94℃變性4 min，每試管取2 μL產(chǎn)物在DNA序列分析儀中電泳2 h；收集電泳過程中不同時間出現(xiàn)的不同強(qiáng)度的熒光素和顏色，運用Genescan軟件分析收獲的數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以兩樣本t檢驗比較組間殺傷率之間的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PBMC的殺傷活性變化經(jīng)KG1a細(xì)胞抗原誘導(dǎo)后PBMC細(xì)胞殺傷KG1a細(xì)胞活性顯著高于誘導(dǎo)前，在不同效靶比時誘導(dǎo)后的殺傷率顯著性高于誘導(dǎo)前（P＜0.05），且隨效靶比增高殺傷率增高。見表1。

2.2 KG1a細(xì)胞抗原刺激前后T細(xì)胞表型變化正常健康人PBMC 中T淋巴細(xì)胞以CD4+T淋巴細(xì)胞為主，經(jīng)KG1a 抗原刺激后CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯增加，提示逐漸向轉(zhuǎn)化CD8+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。見表2、圖1。

表1 不同效靶比KG1a 抗原誘導(dǎo)前后PBMC細(xì)胞殺傷活性變化Tab.1 Cytotoxicities of PBMC pre-and post-induced by antigen of KG1a cell against KG1a cell at different E：T ratios x±s，%

表2 KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PBMC 中T細(xì)胞亞群的變化Tab.2 Immunophenotype of T cells pre-and post-induced by antigen of KG1a cell ±s，%

表2 KG1a細(xì)胞抗原刺激前后PBMC 中T細(xì)胞亞群的變化Tab.2 Immunophenotype of T cells pre-and post-induced by antigen of KG1a cell ±s，%

組別誘導(dǎo)前KG1a 抗原誘導(dǎo)后t值P值CD4+53.19±5.61 44.91±4.20 3.479 0.040 CD8+43.44±3.52 56.94±3.65-5.176 0.014 CD4/CD8 1.32±0.17 0.91±0.08 7.566 0.005

圖1 KG1a細(xì)胞抗原誘導(dǎo)后T細(xì)胞表型Fig.1 Changes of T cell immunophenotype induced by antigen of KG1a cell

2.3 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果未誘導(dǎo)前T細(xì)胞均表達(dá)全部的TCR Vαβ家族基因，經(jīng)KG1a抗原誘導(dǎo)后的T細(xì)胞TCR Vαβ家族基因部分不表達(dá)。

2.4 TCR基因掃描正常健康人TCR Vα、Vβ家族譜型呈8峰以上的中間高兩端低的高斯分布，表現(xiàn)為多克隆性T細(xì)胞。經(jīng)KG1a 抗原刺激后T細(xì)胞不再全部呈多克隆，出現(xiàn)單克隆趨勢、單克隆及寡克隆，某些亞家族甚至消失。見表3、4和圖2。

3 討論

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用，具有強(qiáng)大的抗感染、免疫監(jiān)視功能[11-13]。T淋巴細(xì)胞別靶細(xì)胞表面抗原肽：MHC-Ⅰ類分子復(fù)合物，激活后增殖、活化為具有殺傷活性的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）[14-15]。在過繼性免疫治療和異基因造血干細(xì)胞移植中，供者T淋巴細(xì)胞經(jīng)受者白血病細(xì)胞抗原刺激后增殖活化，能特異地識別并殺傷少量殘留的白血病細(xì)胞，在清除微小殘留病變（MRD）和移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）中起重要作用[16-17]。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生和生長不僅凋亡相關(guān)基因發(fā)生改變，其免疫原性也發(fā)生了改變，尤其在和免疫系統(tǒng)進(jìn)行對抗作用后，如MHC 抗原表達(dá)缺失或降低，黏附分子、共刺激分子表達(dá)下降，抗原加工提呈障礙，低表達(dá)NKG2D 配體等，這些免疫原性改變不足以被活化淋巴細(xì)胞識別和殺傷，逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)視[18-20]。應(yīng)用小分子化合物、單克隆抗體和腫瘤抗原肽等方法處理腫瘤細(xì)胞可改變其抗原結(jié)構(gòu)，提高免疫原性，能增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，是近年來免疫治療關(guān)注熱點[21-22]。

表3 KG1a細(xì)胞抗原誘導(dǎo)后PBMC的TCRVα亞家族克隆情況Tab.3 The usage of T-cell receptor α chain variable region（TCRVα）subfamily and proliferation characteristics of T-cell clones post-induced by antigen of KG1a cell

表4 KG1a細(xì)胞抗原誘導(dǎo)后PBMC的TCRVβ亞家族的克隆情況Tab.4 The usage of T-cell receptor β chain variable region（TCRVβ）subfamily and proliferation characteristics of T-cell clones post-induced by antigen of KG1a cell

本研究應(yīng)用制備的急性白血病細(xì)胞KG1a 抗原和外周血單個核細(xì)胞（PBMC）混合培養(yǎng)，分析刺激前后PBMC 殺傷KG1a細(xì)胞活性的變化。結(jié)果顯示在經(jīng)KG1a細(xì)胞抗原誘導(dǎo)后PBMC細(xì)胞殺傷KG1a細(xì)胞活性顯著高于誘導(dǎo)前，在不同效靶比時誘導(dǎo)后的殺傷率顯著性高于誘導(dǎo)前（P＜0.05），且隨效靶比增高殺傷率增高。考慮到PBMC 中T細(xì)胞為主要的免疫活性細(xì)胞，筆者進(jìn)一步檢測了刺激后PBMC 中T細(xì)胞免疫表型變化，結(jié)果顯示正常健康人PBMC 中T淋巴細(xì)胞以CD4+T淋巴細(xì)胞為主，經(jīng)KG1a 抗原刺激后CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯增高，與誘導(dǎo)前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示逐漸向轉(zhuǎn)化CD8+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這可能是殺傷活性提高的原因之一。

T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）為T細(xì)胞表面特征性標(biāo)志。有三個高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3 變異最大，直接決定了TCR 抗原結(jié)合特異性。在TCR 識別MHC-抗原肽復(fù)合體時，CDR1、CDR2 識別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3 直接與抗原肽相結(jié)合，具有高度的多態(tài)性。CDR3表達(dá)的頻率可以反映T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的程度，從而反映T細(xì)胞功能和狀態(tài)[23]。筆者進(jìn)一步應(yīng)用PCR 擴(kuò)增KG1a 抗原刺激前后PBMC 中T淋巴細(xì)胞TCR Vα 32個家族Vβ 24個家族CDR3，并應(yīng)用基因掃描技術(shù)分析誘導(dǎo)前后PBMC 中T細(xì)胞克隆的變化。結(jié)果顯示，T淋巴細(xì)胞未受到抗原刺激時，32個TCR Vα家族24個TCR Vβ家族譜形呈8峰以上中間高兩邊低條帶，各峰之間間隔分布均勻，表明為多克隆性，無某個家族的優(yōu)勢表達(dá)。誘導(dǎo)后TCR家族不再為多克隆，某些Vα和Vβ亞家族出現(xiàn)單克隆、寡克隆，及寡克隆趨勢，有的甚至缺失。某些家族出現(xiàn)不同于誘導(dǎo)前的克隆峰，提示T細(xì)胞受抗原刺激后，一些亞家族T細(xì)胞得到顯著擴(kuò)增。但本研究尚未發(fā)現(xiàn)TCR Vα和Vβ家族變化的規(guī)律性，這可能與樣本量不足夠大有關(guān)，也有可能與四例健康個體的遺傳背景有關(guān)，還有待以后進(jìn)一步研究。

圖2 KG1a細(xì)胞抗原刺激后PBM的TCRVα β家族的克隆變化Fig.2 Changes of T cell clonity after induced by antigen of KG1a cell