靶向超聲造影在體定量評價大鼠移植后卵巢新生血管

王國棟，張 姍，狄 娜，穆玉明*

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830000；2.中山大學孫逸仙紀念醫院超聲科，廣東 廣州 510120)

卵巢移植技術為卵巢功能衰退患者提供了一種保存生育能力的有效方法[1-2]。移植后卵巢部位血管生成速度和密度直接影響卵巢存活和功能恢復[3]，但長期以來缺乏在體評價移植后卵巢新生血管狀態的無創方法[4]。LI等[5]發現，通過連接腫瘤血管特異性配體，以靶向造影劑進行超聲造影，可檢測腫瘤新生血管。抗苗勒管激素(anti-Mullerian canal hormone, AMH)僅由卵巢顆粒細胞特異性分泌,其他組織少有表達[6-7]。本研究嘗試通過制備具有卵巢組織靶向性的AMH-靶向納米泡(AMH-targeting nanobubble, AMH-NB)，實現在體無創評價大鼠移植后卵巢新生血管。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 選取SD雌性大鼠10只，鼠齡7～8周，體質量200～220 g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，倫理審查批準編號(SYSU-LACUC-2019-B463)。以3%戊巴比妥鈉腹腔注射(45 mg/kg體質量)麻醉動物，摘除兩側卵巢后，立即將一側卵巢皮質移植到右側腹股溝區皮下，之后荷包縫合皮膚，建立大鼠自體卵巢移植模型[8]。將手術次日記為移植后第1天。

1.2 材料與設備 造影劑聲諾維(SonoVue，Bracco公司)，AMH抗體(北京Bioss公司)，免疫組織化學一抗CD34(Abcom公司)，二抗即用型山羊抗兔二步法試劑盒，熒光二抗為AF-488，紅細胞計數板。納米泡粒徑檢測儀ZETASIZER Nano-ZS90，GE-vivid 7超聲診斷儀，高頻探頭i13L，頻率14 MHz。

1.3 制備非靶向微泡(non-targeting nanobubble, N-NB)和AMH-NB 采用“薄膜水化法”制備N-NB[9]，以“親和素-生物素”橋接法構建AMH-NB[10]。采用共聚焦顯微鏡檢測AMH是否與納米泡連接。

1.4 超聲造影 術后第7天麻醉并保定動物，選取造影模式，機械指數0.06，記錄時間為10 min，經尾靜脈團注6×106/ml造影劑0.1 ml，對全部大鼠分別隨機采用3種造影劑(SonoVue、N-NB和AMH-NB)進行3次檢查，每次間隔30 min。由2名分別具有工作7、8年工作經驗的超聲醫師采用雙盲法分析數據，通過造影時間-強度曲線獲取峰值強度(peak intensity, PI)和達峰時間(time to peak, TTP)。

1.5 病理和免疫熒光分析 完成造影后，取9只大鼠，分為3組(每組3只)，每組分別注入1種造影劑，之后處死動物，留取移植后卵巢組織。參照劉艷麗等[11]方法以4%甲醛固定標本，石蠟包埋切片，行HE染色，并以SP法行CD34免疫組織化學染色。于光學顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡視野(HP)計數呈棕黃色的陽性血管, 取平均值作為卵巢微血管密度[4](microvascular density, MVD)。制備冰凍切片，厚度為5 μm，經甲醇固定，加入一抗AMH抗體(1∶100稀釋)，放入濕盒內4℃過夜；之后加入熒光二抗AF-488(1∶100稀釋)，顯色，脫水，封片，觀察攜帶DiL的紅色微泡在血管內外及其在組織間隙的微泡是否與AMH抗體結合。

1.6 統計學分析 采用SPSS 25.0統計分析軟件。計量資料采用±s表示，行兩獨立樣本t檢驗；用單因素方差分析進行多組比較，兩兩比較采用LSD法。采用Pearson相關性分析或線性回歸分析觀察PI、TTP與MVD的相關性：│r│≥0.8高度相關性, 0.5≤│r│<0.8中度相關性，0.3≤│r│<0.5低度相關性，0<│r│<0.3弱相關。P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 N-NB和AMH-NB表征 納米泡肉眼觀為乳白色，光學顯微鏡下呈圓形結構。表面連接AMH抗體后的AMH-NB在激光共聚焦顯微鏡下呈綠色環狀，分布均勻(圖1)。ZETASIZER Nano-ZS90及紅細胞計數板檢測的N-NB、AMH-NB直徑、濃度差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)。

表1 N-NB與AMH-NB微泡直徑及濃度比較(±s)

表1 N-NB與AMH-NB微泡直徑及濃度比較(±s)

圖1 N-NB和AMH-NB形態和粒徑分布曲線圖 顯微鏡下觀察，微泡分布均勻，NB表面成功攜帶AMH抗體表達綠色(×400)

圖2 超聲造影圖像及參數分析 白圈示ROI，AMH-NB超聲造影增強幅度高于SonoVue及N-NB (*：P<0.05)

2.2 二維超聲及超聲造影 二維超聲觀察，移植后卵巢均見包膜形成。圖2為SonoVue、N-NB及AMH-NB超聲造影圖像，單因素方差分析3組間造影參數PI、TTP差異均有統計學意義(F=83.04、666.17，P均<0.05，表2)，兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.3 病理 肉眼觀察移植物表面呈粉紅色具有光澤,可見豐富血管爬行其上，卵巢移植成功率為100%。光鏡下移植后卵巢中可見未凋亡的卵泡，其形態正常。免疫組織化學CD34結果顯示移植后卵巢組織的MVD平均值為(61.20±6.84)/HP(圖3)。激光共聚焦觀察，組織免疫熒光AMH-NB進入組織間隙與AMH結合，呈黃色(圖4)。

2.4 相關性分析與線性回歸分析 移植后卵巢MVD與AMH-NB造影所見PI、TTP呈高度相關(r=0.84、-0.84,P均<0.05)，SonoVue(r=0.67、-0.71，P均<0.05)、N-NB(r=0.65、-0.68，P均<0.05)造影所見PI、TTP分別與MVD呈中度相關(圖5)。

3 討論

AMH與卵巢移植物的存活及卵泡功能密切相關。研究[12]顯示，通過檢測AMH水平，可評價移植卵巢是否成活。血管相關抗體如CD31和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被廣泛用于血管靶點，但并無特異性，且卵巢移植物屬乏血供器官，常規血管相關靶點并不能敏感識別其內新生血管，故本研究以AMH作為靶向超聲造影的靶點。

制備靶向超聲造影劑是實現靶向顯影的前提。本研究所制備的造影劑N-NB及AMH-NB粒徑均達到納米級；NB攜帶抗體后粒徑明顯大于非靶向納米泡，濃度也明顯低于非靶向納米泡，可能是攜帶抗體過程中需要反復離心和洗滌納米泡所致，但AMH-NB的粒徑仍為納米級且濃度仍維持在2.9×108/ml，而體內實驗所用微泡濃度為6×106/ml，對后續實驗并無影響。

表2 采用3種造影劑進行超聲造影所見大鼠移植卵巢組織參數PI、TTP比較(±s)

表2 采用3種造影劑進行超聲造影所見大鼠移植卵巢組織參數PI、TTP比較(±s)

造影劑種類PI(dB)TTP(s)SonoVue4.15±0.8328.71±1.18N-NB6.16±0.4454.35±1.73AMH-NB7.93±0.6542.53±1.74F值83.04666.17P值<0.01<0.01

圖3 病理組織學分析 A.光鏡下觀察HE染色片(×200)可見卵泡形態正常； B.CD34免疫組織化學染色(×400)見移植后卵巢新生血管表達，呈棕黃色

研究[13]表明，納米泡的血管外滲能力優于普通微泡，其PI更高。本研究顯示N-NB的PI較SonoVue增強1.5倍(6.16±0.44 vs 4.15±0.83)，可能因為納米泡粒徑較小，能克服普通微泡的局限性，通過血管內皮間隙進入卵巢組織間隙，增強滲透效應，利于保留，實現被動靶向作用[14]，集聚的納米泡表現出較持續的超聲增強顯影效果，這一特性也為納米泡靶向探測卵巢特異性表達分子奠定了基礎。GAO等[15]報道，與非靶向納米泡相比，靶組織對靶向納米泡的攝取增強。本研究AMH-NB造影所示PI較N-NB增高1.3倍(7.93±0.65 vs 6.16±0.44)，組織免疫熒光成像顯示NB在移植后卵巢組織間隙中呈現高度聚集狀態，提示AMH-NB與AMH成功結合，進一步證實了AMH-NB的靶向性，與LI等[16]的研究結果一致，提示AMH是良好的分子影像學靶點。本研究針對大鼠自體移植卵巢，理論上亦適用于同樣分泌AMH的異體移植卵巢[17]，通過AMH-NB可實現對移植后卵巢組織的靶向顯影，并增強靶組織攝取解決了以往微泡不能進入組織間隙實現全面顯影的難題。

圖4 病理組織免疫熒光(×400) 細胞核DAPI染色表達藍色熒光，AMH抗體染色表達綠色熒光，攜帶Dil的微泡表達紅色熒光。SonoVue紅色微泡不進入組織；N-NB紅色微泡可在卵巢組織間隙表達，不與AMH結合；AMH-NB的組織間隙有大量紅色微泡表達，在Merge中可與AMH結合，呈棕黃色

圖5 相關性分析 SonoVue、N-NB、AMH-NB造影所示PI與MVD的線性回歸方程(A～C)及SonoVue、N-NB、AMH-NB造影所示TTP與MVD的線性回歸方程(D～F)

本研究SonoVue造影所示TTP明顯早于NB，其原因如下：①SonoVue是血池顯像劑，通過血管內皮間隙進入組織需要一定時間[18]；②血管管徑越小，其阻力越大[19-20]，NB較SonoVue灌注的血管更細小、阻力更大，導致TTP延遲。AMH-NB的TTP較N-NB提前，可能是進入組織間隙的AMH-NB微泡能夠快速與AMH結合，故TTP較快。通過比較TTP進一步驗證了AMH-NB可增強移植后卵巢組織的靶向顯影。

既往研究[21]于大鼠卵巢移植后第3天觀察到毛細血管芽，5～10天可見完整的微血管網。MVD是評價新生血管的金標準[4]。本研究通過CD34染色證實卵巢移植物存在新生血管表達，相關性分析結果顯示AMH-NB造影所示PI、TTP值與MVD呈高度相關，而SonoVue和N-NB造影所示PI、TTP值與MVD呈中度相關，表明以AMH-NB進行超聲造影能有效量化評價大鼠移植卵巢的微血管密度。

本研究的不足之處：未能確定AMH-NB超聲造影最佳造影參數；僅觀察了移植后 7天卵巢早期新生血管，AMH-NB超聲造影對移植后卵巢的長期檢測效果有待驗證。