lncRNA MIR31HG對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及作用機制研究

彭書旺，陳露陽

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院 胃腸甲狀腺血管外科，湖南 長沙 410007）

甲狀腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤發病率的第7位，在女性中居第4位，是增長最快的惡性腫瘤之一[1-3]。甲狀腺癌術后預后較好，但仍有約30%患者出現復發轉移，因此探索甲狀腺癌復發轉移的機制具有重要意義[4-5]。MIR31HG 在不同癌癥中作用不同，YANG 等[6]發現MIR31HG 在胰腺導管癌中發揮促癌作用。而YAN 等[7]發現MIR31HG 在肝細胞癌中發揮抑癌作用。目前尚未有研究報道MIR31HG在甲狀腺癌中的作用。本研究擬通過臨床資料分析及體外實驗研究MIR31HG 在甲狀腺癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取2018年8月—2019年4月在湖南省中醫藥大學第一附屬醫院行甲狀腺癌根治術的48例患者的新鮮癌組織及癌旁組織標本，男女各24例。人永生化正常甲狀腺細胞系Nthy-ori 3-1、人甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid,PTC）細胞系TPC-1、K1及BCPAP 由湖南省中醫藥大學基礎醫學院實驗室饋贈，Trizol RNA 提取試劑、RNA 保護液及轉染試劑Lipofectamine 2000 均購自美國Thermo Fisher公司，RNA 逆轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，qRT-PCR 試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，BCA 法蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，PTEN 抗體（ab32199）購自美國Abcam公司，pan-Akt 抗體（#4685）、p-Akt（Ser473）抗體（#4060）購自美國Cell Signaling Technology公司，內參GAPDH（10494-1-AP）抗體、鼠二抗及兔二抗購自美國Proteintech公司，RPMI 1640 無血清培養基及FBS 購自以色列Biological Industries公司，lncRNA MIR31HG 小干擾RNA 序列及對照序列由廣州銳博生物技術有限公司合成，lncRNA MIR31HG 引物及內參Actin 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 數據庫分析筆者利用GEPIA 在線數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn）分析lncRNA MIR31HG 在各種癌癥及甲狀腺癌中的表達。其數據主要來源于TCGA和GTEx project數據庫。

1.2.2 RNA提取選取患者癌組織及癌旁組織標本，并剪成1 mm×1 mm×1 mm 小塊放入RNA 保護液中防止RNA 降解，標本立即放入液氮冷凍保存，選取患者組織標本提取RNA，提取前先液氮預冷研缽，在研缽中將組織磨成粉末，加入Trizol RNA 提取試劑裂解細胞，參照Trizol 說明書分步提取組織RNA，并測定RNA濃度，選取OD260/OD280 在1.9～2.1的RNA進行后續實驗，保證RNA的完整性，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄合成cDNA，細胞樣本RNA提取方法同上，提取的RNA 置于-80℃保存。

1.2.3 qRT-PCR采用常規Trizol 法分別提取癌組織、癌旁組織樣本和Nthy-ori 3-1、TPC-1、K1及BCPAP 細胞系總RNA，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄成cDNA，參照qRT-PCR 試劑盒說明書采用qPCR 二步法進行實驗，反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，共計40個循環。利用β-actin作為內參，采用2-△△Ct法計算lncRNA MIR31HG 在不同樣本中的相對表達量。lncRNA MIR31HG 正向引物：5'-TATATCAGCATCCACAACCT-3'，長度20 bp；反向引物：5'-GCCAACCAACAAGCATTA-3'，長度18 bp；β-actin正向引物：5'-TGCGTGACA TTAAGGAGAA-3'，長度19 bp；反向引物：5'-AAGGAA GGCTGGAAGAGT-3'，長度18 bp。將癌旁組織樣本或Nthy-ori 3-1 細胞系相對表達量設為1，計算癌組織、TPC-1、K1及BCPAP 中lncRNAMIR31HG表達情況，實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 細胞培養將Nthy-ori 3-1、TPC-1、K1及BCPAP 細胞系培養于含10% FBS、1% 100μg/ml 青霉素及100μg/ml 鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中，置于37℃、5%二氧化碳細胞培養箱中培養。

1.2.5 細胞轉染及分組將TPC-1 細胞胰酶消化并接種于6孔板內，待第2天細胞融合度為70%～90%，參照Lipofectamine 2000 Transfecon Reagent 說明書，轉染3條lncRNA MIR31HG siRNA作為實驗組，分別為siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3組。將作為對照的siRNA-NC組轉染24 h后，提取細胞RNA 樣本，qRT-PCR 驗證lncRNA MIR31HG的抑制效率，保證lncRNA MIR31HG 抑制率＞60%，用于后續實驗研究。lncRNA MIR31HG siRNA-1（序列：5'-UUCAACUUCUCACACAAAGCG-3'，屏蔽序列位置為751～773，共22個核苷酸）、siRNA-2（序列：5'-UCAACUUCUCACACAAAGCGC-3'，屏蔽序列位置為784～806，共22個核苷酸）、siRNA-3（序列：5'-AAAAGCAUCCUGAUUUCUCAA-3'，屏蔽序列位置為1 032～1 054，共22個核苷酸）及相應陰性對照序列3條siRNA 均可以靶向lncRNA MIR31HG的4個轉錄本（Accession Number為NR_027054.2、NR_152877.1、NR_152878.1和NR_152879.1）。

1.2.6 MTT檢測細胞增殖能力TPC-1 細胞轉染lncRNA MIR31HG 小干擾RNA siRNA-1、siRNA-3及陰性對照序列24 h后，收集對數期生長的實驗組及siRNA-NC組細胞，調整細胞濃度，取100μl 接種于96孔板，保證每孔約2 000個細胞（5×105個/ml），分別于培養0、24、48、72及96 h后更換培養基，每孔100μl，向每孔加入10μl MTT 工作液，繼續培養4 h，小心吸掉上清，每孔加入100μl 二甲基亞砜37℃孵育10 min，使結晶物充分溶解。在570 nm 波長處利用酶標儀測定各孔OD值，實驗重復3次，取平均值并繪制增殖曲線。

1.2.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力預先用Marker筆在6孔板背后每隔0.5 cm 劃一道橫線。培養各組細胞至對數期，按每孔5×105個/ml 接種入6孔板，37℃細胞培養箱內培養過夜，待第2天細胞剛好鋪滿，用20μl 槍頭抵住直尺，垂直于橫線進行劃痕，PBS洗2次，分別加入無血清培養基，于100倍鏡下拍照，記錄0 h 劃痕位置及寬度，繼續培養24 h后，在100倍鏡下選取與0 h 同一位置視野進行拍照，測定細胞遷移距離，計算劃痕愈合率，計算公式：愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/（0 h 劃痕寬度），實驗重復3次，取平均值。

1.2.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力將生長于對數期的實驗組及siRNA-NC組細胞用胰酶消化并吹打均勻，1 000 r/min 離心3 min，用不含血清的RPMI 1640培養基重懸細胞，細胞計數并將細胞密度調整至2×104個/ml，取200μl 細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含10% FBS的完全培養基，培養24 h后用PBS輕洗2遍，甲醇固定細胞，用棉簽小心擦拭掉上室細胞，0.1%結晶紫溶液染色，染色30 min后顯微鏡下100倍視野觀察，分別取左上、左下、右上、右下及中間共5個視野，計算穿膜細胞數，實驗重復3次，取平均值。

1.2.9 Western blotting提取siRNA-1組、siRNA-3組及siRNA-NC組細胞總RNA及蛋白，用qRT-PCR反應驗證PTEN及Akt的表達，重復3次，每次將siRNA-NC組表達量設置為1，計算實驗組PTEN及Akt相對表達量。Western blotting檢測蛋白相對表達量，BCA 法測定蛋白濃度，各取40 mg 蛋白加入上樣緩沖液，100℃煮5 min 變性，10% SDS-PAGE 電泳膠上樣，電泳條件：濃縮膠80 V至蛋白Marker分離后，加大電壓到120 V至溴酚藍跑至膠底；轉膜條件：恒壓100 V 轉90 min，含5%脫脂奶粉的TBST 工作液室溫封閉1 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗3遍，5 min/次，二抗室溫孵育1 h，ECL液顯影，并計算灰度值，每次將siRNA-NC組表達量設置為1，計算實驗組PTEN、Akt及p-Akt相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差 （±s）表示，比較用t檢驗、單因素方差分析或重量復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同癌組織及癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較

GEPIA數據庫在線分析顯示，宮頸鱗狀細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、頭頸部鱗癌、胰腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌及前列腺癌組織與癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），宮頸鱗狀細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、頭頸部鱗癌、胰腺癌及甲狀腺癌組織較癌旁組織高，膀胱癌、前列腺癌組織較癌旁組織低。見表1和圖1。

表1 不同癌組織及癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較 （n=48，±s）

表1 不同癌組織及癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較 （n=48，±s）

類型 宮頸鱗狀細胞癌 乳頭狀腎細胞癌 頭頸部鱗癌 胰腺癌 甲狀腺癌 膀胱癌 前列腺癌癌組織 1.433±0.541 1.592±0.644 2.883±0.963 0.997±0.523 2.010±0.880 1.024±0.248 0.081±0.042癌旁組織 0.084±0.036 0.294±0.128 1.314±0.514 0.124±0.051 0.551±0.282 1.875±0.427 0.364±0.127 t值 8.976 15.530 10.670 21.730 29.450 10.424 27.011 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 不同癌組織及癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較 （n=48，±s）

2.2 PTC組織與癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較

PTC組織與癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量分別為（6.650±0.700）和（2.515±0.221），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.635，P=0.000），PTC組織較癌旁組織高（見圖2）。以lncRNA MIR31HG 中位表達量為界，將患者分為高表達組和低表達組，各24例，高表達組與低表達組患者腫瘤大小、腫瘤分期及淋巴結轉移比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。

圖2 PTC組織與癌旁組織lncRNA MIR31HG相對表達量比較

表2 lncRNA MIR31HG 在PTC組織與癌旁組織的相對表達量比較 （n=24）

2.3 不同PTC細胞系lncRNA MIR31HG相對表達量比較

將甲狀腺正常細胞系Nthy-ori 3-1的lncRNA MIR31HG相對表達量設為（1.00±0.00），PTC細胞系TPC-1、K1及BCPAP的lncRNA MIR31HG相對表達量分別為（2.43±0.08）、（1.74±0.05）和（4.38±0.11），經方差分析，差異有統計學意義（F=431.300，P=0.000），TPC-1、K1及BCPAP較Nthy-ori 3-1高，且TPC-1相對表達量最高。見圖3。

圖3 不同PTC細胞系lncRNA MIR31HG相對表達量比較 （±s）

2.4 lncRNA MIR31HG基因沉默對TPC-1 細胞增殖能力的影響

2.4.1 沉默效率驗證將siRNA-NC組lncRNA MIR31HG相對表達量設為（1.000±0.000），siRNA-1組、siRNA-2組及siRNA-3組分別為（0.320±0.020）、（0.540±0.021）和（0.280±0.015），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=330.300，P=0.000），實驗組均較siRNA-NC組下降，其中siRNA-1組與siRNA-3組沉默效率均＞60%（見圖4），因此選取siRNA-1與siRNA-3 小干擾RNA 用于后續實驗研究。

2.4.2 細胞活力驗證siRNA-NC組、siRNA-1組、siRNA-3組0、24、48、72及96 h的OD值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的OD值比較，差異有統計學意義（F=14 192.911，P=0.000）；②各組OD值比較，差異有統計學意義（F=3 661.345，P=0.000）；③各組OD值變化趨勢比較，差異有統計學意義（F=2 374.012，P=0.000）。lncRNA MIR31HG 沉默可明顯降低TPC-1的增殖能力。見表3和圖5。

2.5 lncRNA MIR31HG基因沉默對TPC-1 細胞遷移及侵襲能力的影響

圖4 各組lncRNA MIR31HG相對表達量比較 （±s）

siRNA-NC組、siRNA-1組及siRNA-3組24 h 劃痕愈合率分別為（74.7±0.91）%、（36.1±1.13）%和（20.53±1.60）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=442.700，P=0.000）；siRNA-1組與siRNA-3組較siRNA-NC組降低，表明lncRNA MIR31HG 沉默可明顯降低TPC-1 細胞的遷移能力。見圖6、7。

siRNA-NC組、siRNA-1組及siRNA-3組侵襲至Transwell 小室下室的細胞數分別為（423.00±11.93）、（240.00±12.10）和（224.00±9.45）個，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=97.200，P=0.000）；siRNA-1組、siRNA-3組較siRNA-NC組降低，表明lncRNA MIR31HG沉默可明顯抑制TPC-1 細胞的侵襲能力。見圖8、9。

表3 各組不同時間點OD值比較 （±s）

表3 各組不同時間點OD值比較 （±s）

組別 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h siRNA-NC組 0.205±0.003 0.355±0.033 0.643±0.032 1.251±0.033 2.176±0.055 siRNA-1組 0.206±0.005 0.275±0.003 0.453±0.006 0.791±0.005 1.226±0.015 siRNA-3組 0.206±0.002 0.266±0.004 0.404±0.009 0.686±0.007 1.128±0.015

圖5 各組不同時間點OD值變化趨勢 （±s）

2.6 lncRNA MIR31HG基因沉默對Akt信號通路的影響

各組PTEN mRNA、PTEN蛋白及p-Akt蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；siRNA-1組、siRNA-3組PTEN mRNA和蛋白相對表達量較siRNA-NC組升高，且siRNA-3組最高；siRNA-1組、siRNA-3組p-Akt 蛋白較siRNA-NC組降低，且siRNA-3組最低。各組Akt mRNA和蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）表明lncRNA MIR31HG 沉默可明顯升高PTEN基因的表達，從而抑制Akt的磷酸化。見表4和圖10。

圖6 各組細胞劃痕實驗結果 （×100）

圖7 各組細胞24 h 劃痕愈合率比較 （±s）

圖8 各組侵襲細胞數比較 （±s）

圖9 各組Transwell 小室侵襲實驗結果 （×100）

表4 各組PTEN、Akt及p-Akt mRNA和蛋白的相對表達量比較 （±s）

表4 各組PTEN、Akt及p-Akt mRNA和蛋白的相對表達量比較 （±s）

注：①與siRNA-NC組比較，P＜0.05；②與siRNA-1組比較，P＜0.05。

組別 PTEN mRNA PTEN 蛋白 Akt mRNA Akt 蛋白 p-Akt 蛋白siRNA-NC組 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 siRNA-1組 2.107±0.047① 2.247±0.035① 1.093±0.038 1.077±0.019 0.510±0.017①siRNA-3組 2.537±0.136①② 2.683±0.081①② 1.017±0.034 1.083±0.035 0.413±0.019①②F值 91.290 295.200 2.909 4.049 460.600 P值 0.000 0.000 0.131 0.077 0.000

圖10 lncRNA MIR31HG基因沉默對Akt信號通路的影響

3 討論

有研究發現多種lncRNA的異常表達與甲狀腺癌的發生、發展密切相關[8-10]。雖然lncRNA 沒有開放閱讀框，不能編碼蛋白，但其通過調控基因表達、翻譯后修飾、蛋白穩定性及活性等方式在細胞功能的調控上發揮重要作用。越來越多的研究表明lncRNA的異常表達在腫瘤的發生、發展中發揮了重要作用，lncRNA 通過吸附miRNA 形成ceRNA，從而調控基因的表達是其發揮作用的主要機制之一[11-12]。

lncRNA MIR31HG是miR-31的宿主基因，在多種腫瘤中表達異常，有研究發現lncRNA MIR31HG 在肺癌中高表達，并與患者的不良預后密切相關[13]。其通過與miRNA-214 結合，調控下游基因表達，從而調控非小細胞肺癌的侵襲、轉移[14]。ZHENG 等[15]發現lncRNA MIR31HG還可以通過Wnt/β-catenin信號通路來調控肺癌的侵襲、轉移。WANG 等[16]發現lncRNA MIR31HG 可以通過激活EGFR/PI3K/Akt信號通路增加非小細胞肺癌對吉非替尼的耐藥性。lncRNA MIR31HG的高表達在胰腺癌、口腔癌等癌癥中同樣發揮了促進腫瘤增殖、侵襲及遷移的作用[6、17]。然而也有研究發現在肝癌、胃癌及食管鱗狀細胞癌中，lncRNA MIR31HG與腫瘤的臨床分期及預后密切相關，其表達下調可抑制腫瘤的發生、發展[7，18-19]。lncRNA MIR31HG 在PTC的作用及機制尚未有報道。

本研究通過數據庫分析TCGA 病例資料，結合筆者收集的病例資料發現，PTC組織lncRNA MIR31HG相對表達量較癌旁組織升高，其表達水平與患者腫瘤大小、腫瘤分期及淋巴結轉移情況關系密切。在體外細胞實驗中筆者發現，lncRNA MIR31HG的沉默抑制了TPC-1 細胞系的增殖及遷移、侵襲能力。

為進一步探究lncRNA MIR31HG在PTC發生、發展中的作用及機制，筆者通過文獻閱讀發現lncRNA MIR31HG可以激活Akt 通路[19]。筆者通過在線數據庫miRDB（www.mirdb.org）及miRBase（www.mirbase.org）等網站發現miRNA-575及miRNA-214可以靶向PTEN基因的3'UTR，調控PTEN基因的表達。PTEN基因作為抑癌基因，在Akt 去磷酸化、抑制Akt活化及Akt下游通路的激活方面具有重要作用。本實驗發現lncRNA MIR31HG 沉默可明顯高PTEN基因的表達，但對Akt表達無明顯影響，然而沉默lncRNA MIR31HG后p-Akt的表達明顯下降，表明lncRNA MIR31HG 沉默可能靶向調控PTEN的表達，從而抑制Akt 通路的活化。

綜上所述，lncRNA MIR31HG在PTC組織及細胞系中高表達，與患者腫瘤大小及淋巴結轉移密切相關，下調lncRNA MIR31HG可以抑制TPC-1細胞的增殖、遷移及侵襲能力，其機制可能與lncRNA MIR31HG 通過吸附miRNA 形成ceRNA 調控PTEN表達，從而調控Akt 通路的活化相關。lncRNA MIR31HG 可作為PTC 潛在的預后標志物及治療靶點。