宮頸癌組織中Hippo-Yes相關蛋白1的表達及臨床意義

王文慧，邵志葉，陳豪

（1.杭州市婦產科醫院 病理科，浙江 杭州 310000；2.慈溪市婦幼保健院病理科，浙江 慈溪 315300）

人乳頭瘤病毒感染為宮頸癌發病的根本原因，而宮頸癌發病是一個復雜的過程，其發病機制尚不十分清楚。隨著研究的不斷深入，人們逐漸認識到宮頸癌的發病是一個多因素、多步驟共同導致的過程，從正常宮頸發展到宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN），再發展為宮頸癌。在這個過程中，原癌基因激活和抑癌基因突變或缺失發揮重要作用。關于原癌基因和抑癌基因變化的研究是宮頸癌發病機制研究的熱點。Hippo信號通路為惡性腫瘤的抑制通路，在惡性腫瘤發病中發揮重要作用[1]，Hippo-Yes相關蛋白1（Hippo-Yes-associated protein1,YAP1）位于該通路下游，為Hippo 通路轉錄共激活因子[2]，參與生長、發育及DNA 修復等過程，在結直腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達升高，發揮抑癌基因的角色[3]。本文對宮頸癌組織中YAP1表達進行研究，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月—2019年6月杭州市婦產科醫院和慈溪市婦幼保健院收治的100例宮頸癌患者的宮頸癌組織作為宮頸癌組，100例宮頸CIN 患者的宮頸組織作為CIN組，100例子宮肌瘤患者的正常宮頸組織作為正常組。宮頸癌組年齡（48.75±6.16）歲；臨床分期：I期58例，Ⅱ期42例；鱗癌69例、腺癌31例；低分化19例，中分化42例，高分化39例；宮旁浸潤深度：≤1/3 者31例，＞1/3 者69例；神經脈管浸潤67例；宮旁浸潤65例；淋巴結轉移53例。CIN組年齡（47.59±6.54）歲，正常組年齡（47.82±6.73）歲。納入標準：①正常組選自子宮肌瘤行全子宮切除術患者，病理證實宮頸組織正常；②CIN組選自宮頸錐切患者，病理證實為宮頸CIN；③宮頸癌組為行廣泛性子宮切除術+盆腔淋巴結切除術患者，病理證實為宮頸癌；④3組均臨床資料完整、依從性好、接受正規治療和隨訪，以及足夠樣本量進行免疫組織化學染色。排除標準：①其他惡性腫瘤；②隨訪過程中失訪；③宮頸癌復發；④既往接受放化療等其他治療。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。3組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器鼠抗人YAP1 單克隆抗體購自美國Epitomics公司，二抗購自上海羅氏有限公司，DAB顯色劑購自上海羅氏有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色將3組宮頸組織石蠟切片經烤箱烘烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸緩沖液高溫修復抗原，過氧化氫孵育10 min，加入一抗。兔抗人YAP1 單克隆抗體（1∶400）過夜孵育，加入二抗（1∶2 000）孵育1 h，DAB顯色，HE染色1 min，鹽酸乙醇分化30 s，氨水返藍1 min，常規脫水、透明、封固。陰性對照以PBS代替一抗。結果判斷：YAP1陽性產物主要位于細胞漿和細胞核。①染色程度：無染色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。②陽性細胞率：≤5%計0分；＞5%～25%計1分；＞25%～50%計2分；＞50%～75%計3分；＞75%計6分。染色程度和陽性細胞染色率相乘得到總分：總分0～2分為陰性；總分≥3分為陽性[4]。

1.3 隨訪

定期進行門診或電話隨訪了解患者預后，隨訪開始時間為宮頸癌手術日期，隨訪截止時間為2019年12月31 日或死亡時間。無病生存期（disease-free survival,DFS）為手術日期至出現遠處轉移、復發、死亡或隨訪截止時間；總生存期（total survival,OS）為手術日期至死亡或隨訪截止時間。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meie 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；預后影響因素用多因素Cox 比例風險模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組宮頸組織中YAP1蛋白陽性表達率比較

正常組、CIN組、宮頸癌組宮頸組織中YAP1蛋白陽性表達率分別為13%、42%和78%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=85.930，P=0.000），CIN組、宮頸癌組高于正常組（P＜0.05），且宮頸癌組高于CIN組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組宮頸組織染色 （×400）

2.2 不同因素的宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達率比較

不同臨床分期和有無淋巴結轉移患者宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），臨床分期Ⅱ期宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達率高于I期；有淋巴結轉移宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移。而不同年齡、組織學類型、組織學分級、宮頸浸潤深度、神經脈管是否浸潤及宮旁是否浸潤的宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 宮頸癌YAP1陽性表達組和陰性表達組生存時間比較

100例宮頸癌患者DFS中位數為61.15個月（95% CI：58.76，63.32）。其中，宮頸癌YAP1陽性表達組78例，DFS中位數為54.27個月（95% CI：52.16，67.36），5年DFS率為3.85%（3/78）；YAP1 陰性表達組22例，DFS中位數為87.76個月（95% CI：85.54，90.73），5年DFS率為0.00%（0/22）。兩組DFS比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=5.241，P=0.023），YAP1陽性表達組低于YAP1陰性表達組。見圖2。

100例宮頸癌患者OS中位數為63.57個月（95% CI：61.25，65.02）。其中，宮頸癌YAP1陽性表達組OS中位數為61.27個月（95% CI：58.76，53.64）；YAP1 陰性表達組OS中位數為93.61個月（95% CI：90.25，96.02）。兩組OS比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.201，P=0.014），YAP1陽性表達組低于YAP1 陰性表達組。見圖3。

2.4 YAP1 對宮頸癌預后的影響

以OS為因變量（賦值為總生存期實際值），以YAP1（陽性=1，陰性=0）、腫瘤大小（賦值為實測值）、臨床分期（I期=0，Ⅱ期=1）、淋巴結轉移（無=0，有=1）為自變量，進行逐步多因素Cox 比例風險分析，引入水準為0.05，剔除水準為0.10。Cox 比例風險模型分析結果顯示，YAP1表達、臨床分期及淋巴結轉移為宮頸癌OS的獨立影響因素（P＜0.05）。見表2。

表1 不同因素的宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達率比較 （n=100）

圖2 YAP1不同表達宮頸癌患者的DFS

圖3 YAP1不同表達宮頸癌患者的OS

表2 宮頸癌總生存期影響因素的Cox比例風險分析參數

3 討論

Hippo信號通路參與多種疾病的發生、發展過程，與惡性腫瘤的發病關系密切，尤其與其抑癌基因失活關系密切[5-6]。YAP1被證實為原癌基因，保護多個特異氨基酸結構域，通過這些氨基酸結構域與一些蛋白質發生作用，參與多種信號轉導通路[7]。在Hippo 信號通路中，YAP1 發揮中心效應作用[8]。在生理條件下Hippo信號通路為一條激酶鏈，由多種抑癌因子共同構成，通過使YAP1 磷酸化，進而抑制YAP1 轉錄共激活活性，維持細胞增殖和凋亡的平衡[9-10]。當YAP1 過度表達或活性增加時，可激活下游靶基因表達，從而改變細胞增殖和凋亡的平衡[11-12]。在惡性腫瘤組織中，Hippo信號通路遭到破壞，導致YAP1 去磷酸化，活性增加，活化的YAP1 可誘導細胞增生相關的基因高度表達、抑制凋亡基因過度表達，從而打破細胞增殖和凋亡的平衡，促進細胞過度增殖[13]，導致乳腺癌[14]、胰腺癌[15]等惡性腫瘤的發生、發展。故推測YAP1 在惡性腫瘤的發生、發展中發揮致癌基因角色[16-17]。

HE 等[18]發現，Hippo/YAP途徑和HPV致瘤蛋白相互作用調節宮頸癌的進展。ZHANG 等[19]發現，miR-136/TFCP2/YAP 途徑在宮頸癌中發揮致癌作用。惠慧等[20]發現，沉默YAP1 可影響宮頸癌細胞的增殖和侵襲。上述研究表明，YAP1 可通過多種途徑參與宮頸癌的發生、發展過程，但上述研究主要對宮頸癌細胞進行研究。本文對宮頸癌組織中YAP1的表達及臨床意義進行研究，發現宮頸癌組織中YAP1高表達率高于宮頸CIN組織，宮頸CIN組織中YAP1高表達率高于正常宮頸組織，宮頸癌組織中YAP1高表達與宮頸癌的臨床分期和淋巴結轉移關系密切。李靈芝等[21]對宮頸癌組織中YAP1表達進行研究發現，YAP1蛋白在宮頸癌前病變中呈高表達，在宮頸癌篩查中具有一定價值。本研究結果與該研究結果一致，表明YAP1 在宮頸癌癌前病變中已表達異常，檢測YAP1表達在宮頸癌篩查和防治中具有一定價值。李娜等[4]研究發現，YAP 在宮頸癌組織中高表達，其高表達與宮頸癌淋巴結轉移關系密切，與宮頸癌臨床分期無關。而本研究結果顯示，宮頸癌組織中YAP1與宮頸癌臨床分期和淋巴結轉移均有關。本研究與李娜等[4]研究結果不完全一致，分析可能與病例數少、病例來自不同醫院等因素有關。結合上述基礎研究結果得知，沉默YAP1 可影響宮頸癌細胞增殖和侵襲，分析YAP1在宮頸癌增殖和侵襲中發揮重要作用，YAP1高表達可促進宮頸癌增殖和侵襲。

本文對YAP1高表達與宮頸癌預后的關系進行研究，發現YAP1高表達組患者DFS和OS較短，YAP1表達為宮頸癌OS的獨立影響因素。分析在宮頸癌組織中，Hippo信號通路受到破壞，導致YAP1 去磷酸化，YAP1 活性增加，活化的YAP1 可誘導宮頸癌細胞增殖，促進其侵襲能力，從而促進宮頸癌的發生、發展，宮頸癌臨床分期較高，并出現淋巴結轉移，導致宮頸癌嚴重程度增加，預后較差。

綜上所述，宮頸癌組織中YAP1 呈高表達，YAP1表達水平一定程度上可反映宮頸癌的嚴重程度，在預測預后上也具有一定的輔助價值。