外周血microRNA-24、YKL-40與兒童病毒性肺炎的相關性

吳捍衛，王展，呂美艷，王一

（1.永康市第一人民醫院 檢驗科，浙江 永康 321300；2.浙江大學醫學院附屬兒童醫院泌尿外科，浙江 杭州 310052）

感染性肺炎是兒科常見疾病，＞50%患兒直接感染病毒或繼發于支原體、細菌感染引起的病毒[1]。鑒于病毒性肺炎具有季節性的特點，例如流感病毒、新型冠狀病毒、呼吸道合胞病毒等都可能引發大范圍爆發和流行，嚴重危及兒童的生命健康。因此在治療過程中，尋找有效的生物標志物用于評估病情進展、臨床療效和預后判斷具有重要的臨床意義。YKL-40 屬于一類典型的分泌型糖蛋白，與炎癥反應密切相關，而且在肺部疾病的發生、發展過程中也發揮重要作用[2]。李智瓊等學者[3]證實，YKL-40 在支原體肺炎患兒血清中含量升高，并且可用于輔助診斷和評價病情嚴重程度及預后。KORTHAGEN 等[4]也發現，肺泡灌洗液中YKL-40含量與肺纖維化患者預后呈負相關。但是其在病毒性肺炎患兒血清中的含量及臨床意義未見學者關注。另外考慮到血清中很多蛋白分子的表達具有不穩定性，易被蛋白酶所降解，因此從上游水平尋找相關的microRNA（miRNA）作為檢測指標。筆者通過在線生物學軟件篩查發現，YKL-40 編碼基因CHI3L1是miR-24的下游靶基因[5]，而且眾多研究也證實，miR-24在炎癥疾病中也屬于功能性基因[6]。因此本實驗擬研究浙江大學醫學院附屬兒童醫院病毒性肺炎患兒血清miR-24、YKL-40與疾病嚴重程度、肺功能及預后的相關性，以期為指導臨床診斷和個體化治療提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2019年4月在浙江大學醫學院附屬兒童醫院住院的117例病毒性肺炎患兒作為實驗組。其中，男性74例，女性43例；年齡2～11歲，平均（5.34±2.45）歲；流感病毒37例，呼吸道合胞病毒31例，副流感病毒19例，腺病毒12例，巨細胞病毒11例，EB病毒7例。納入標準：①參考《兒童社區獲得性肺炎管理指南（2013 修訂）》[7]關于病毒性肺炎和重癥肺炎的診斷標準；②經血清分子生物學及直接免疫熒光法檢測病毒特異性中和抗體；③所有重癥肺炎患兒需經2位兒內科副主任及以上醫師確診；④由患兒法定監護人簽署知情同意書。排除標準：①合并支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺栓塞；②急慢性炎癥反應；③嚴重肝腎功能障礙；④免疫系統疾病；⑤先天性疾病；⑥反復呼吸道感染。根據不同預后分為痊愈組、好轉租及遷延難愈組。另外選取同期本院健康體檢兒童30例作為對照組。納入標準：①年齡與納入的病毒性肺炎患兒相匹配；②無基礎性疾病；③近3個月內無呼吸道感染病史；④各項血常規指標和血生物化學指標均正常。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2 主要儀器及試劑

MasterScreen Paed型肺功能儀（德國耶格公司），One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司），YKL-40 ELISA試劑盒（美國R&D公司），利巴韋林注射液（馬鞍山豐原制藥有限公司，生產批號：20150114），阿奇霉素注射液（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，生產批號：20150103）。

1.3 治療方法

所有患兒臨床會診后靜脈滴注利巴韋林注射液10 mg/kg，1次/d；合并細菌感染者靜脈滴注阿奇霉素注射液（0.125 g 溶于250 ml 生理鹽水）10 mg/kg，1次/d，7 d為1個療程。另外給予退熱、鎮咳、祛痰等對癥治療，1～2個療程后，采集晨起空腹血液標本。

1.4 檢測指標

1.4.1 血清YKL-40所有患兒入院就診時第一時間采集肘靜脈血6 ml，靜置20 min，3 000 r/min 離心20 min，離心半徑10 cm，取上清，采用YKL-40 ELISA試劑盒檢測血清YKL-40含量。

1.4.2 血清miR-24 mRNA采血方法同1.4.1，留取部分血清標本，加入Trizol 試劑，提取血清總RNA，采用Thermo Fisher miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒進行逆轉錄反應生成cDNA。采用SYBR Green 法行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR），冰浴中配制10μl PCR 反應體系：正反向引物各0.2μl、2×SYBR Green I Msater 5μl、cDNA 模 板1μl、適量去離子水。PCR 反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性5 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計36個循環，從60℃緩慢升至97℃繼續延伸并收集熒光信號，繪制熔解曲線。以小分子U6作為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.4.3 潮氣呼吸肺功能采血當日患兒口服5%水合氯醛或自然睡眠狀態下，戴上合適面罩，采用MasterScreen Paed型肺功能儀檢測患兒潮氣呼吸肺功能，計算達峰時間比（tPTEF/tE），即到達呼氣峰流速的時間與呼氣時間之比。

1.5 臨床療效評價標準

治愈：患兒臨床癥狀消失，體溫恢復正常，且胸部X射線檢查顯示肺部病灶完全消失；好轉：患兒臨床癥狀明顯減輕，體溫恢復正常，胸部X射線檢查顯示肺部病變基本或大部分吸收；無效：遷延難愈者或死亡者。總有效率（%）＝（治愈+好轉）/總例數×100%。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差 （±s）表示，比較用t檢或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；相關性分析用Pearson 法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒性肺炎患兒血清miR-24 mRNA、YKL-40表達水平

對照組與實驗組血清miR-24 mRNA和YKL-40表達水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組血清miR-24 mRNA相對表達量較對照組低，而YKL-40含量較對照組高。見表2。

表2 兩組血清miR-24 mRNA、YKL-40蛋白表達水平比較 （±s）

表2 兩組血清miR-24 mRNA、YKL-40蛋白表達水平比較 （±s）

組別 n miR-24 mRNA YKL-40/（ng/ml）對照組 30 1.00±0.18 21.17±6.43實驗組 117 0.83±0.15 66.59±17.48 t值 5.309 13.964 P值 0.000 0.000

2.2 不同臨床病理特征患兒血清miR-24 mRNA、YKL-40表達水平

不同年齡、性別、肺炎類型、病毒類型及是否合并細菌感染患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40表達水平比較，經t檢驗或方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。重癥與輕癥患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40表達水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），重癥肺炎患兒血清miR-24 mRNA相對表達量較低，而YKL-40含量較高。見表3。

2.3 病毒性肺炎患兒的臨床轉歸

經治療后，73例患兒治愈出院，26例患兒出院時胸部X射線檢查顯示仍有極少部分病變未吸收，14例患兒遷延難愈，4例患兒死亡。

2.4 病毒性肺炎患兒治療前后血清miR-24 mRNA、YKL-40表達水平的變化

病毒性肺炎患兒不同預后組治療前后血清miR-24 mRNA和YKL-40的差值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；遷延難愈組低于痊愈組和好轉組（P＜0.05），好轉組低于痊愈組（P＜0.05）。見表4。

表3 不同臨床病理特征患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40蛋白表達水平比較 （±s）

表3 不同臨床病理特征患兒血清miR-24 mRNA和YKL-40蛋白表達水平比較 （±s）

臨床病理特征 n miR-24 mRNA YKL-40/（ng/ml）年齡2～＜7歲 85 0.81±0.17 66.12±16.53 7～11歲 32 0.86±0.15 68.73±17.09 t值 1.462 0.754 P值 0.146 0.452性別男74 0.84±0.16 67.34±17.41女43 0.83±0.15 65.59±16.93 t值 0.333 0.530 P值 0.739 0.598肺炎類型支氣管肺炎 59 0.84±0.13 64.42±18.49毛細支氣管肺炎 35 0.81±0.15 67.21±18.19間質性肺炎 19 0.84±0.14 67.05±16.92其他 4 0.79±0.14 65.17±17.12 F值 0.492 0.215 P值 0.689 0.886臨床病理特征 n miR-24 mRNA YKL-40/（ng/ml）臨床診斷輕癥 81 0.88±0.13 54.23±14.80重癥 36 0.72±0.17 81.71±10.25 t值 5.572 10.009 P值 0.000 0.000病毒類型流感病毒 37 0.84±0.12 65.87±17.11呼吸道合胞病毒 31 0.87±0.16 68.26±17.85副流感病毒 19 0.81±0.15 64.53±16.80腺病毒 12 0.82±0.14 63.21±14.98巨細胞病毒 11 0.81±0.14 65.69±16.76 EB病毒 7 0.83±0.13 66.74±18.25 F值 0.602 0.204 P值 0.699 0.960合并細菌感染是52 0.80±0.13 67.85±17.63否65 0.85±0.16 65.43±16.84 t值 1.823 0.757 P值 0.071 0.451

表4 不同預后患兒治療前后血清miR-24 mRNA和YKL-40的差值比較

2.5 病毒性肺炎患兒治療前血清miR-24 mRNA、YKL-40與肺功能的相關性

經Pearson相關性分析，治療前患兒外周血清miR-24 mRNA與YKL-40呈負相關（r=-0.297，P=0.000），與tPTEF/tE呈正相關（r=0.422，P=0.000）；另外血清YKL-40與tPTEF/tE呈負相關（r=-0.394，P=0.000）。見圖1。

圖1 病毒性肺炎患兒治療前血清miR-24 mRNA、YKL-40與肺功能的相關性

3 討論

兒童肺炎是各個地區兒童醫院的常見疾病，尤其是在學齡前兒童中的致死率較高。本研究患兒經院內治療后，4例死亡，均為＜5歲兒童。病毒、細菌、支原體、衣原體、軍團菌等是引起肺炎的主要病原體。相較于細菌和非典型性病原體，病毒感染與年齡、季節、地域關系密切，易爆發大面積流行。本研究主要納入浙江大學醫學院附屬兒童醫院冬、春季節發病的病毒性肺炎患兒，其中以流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒感染最多見。早期進行病原體檢測可以為臨床治療提供可靠的依據。但是由于病毒性感染和細菌性感染多具有重疊性，臨床癥狀不典型，依靠血常規、C反應蛋白、降鈣素原等作為疾病診斷指標的特異性較低，更不適用于對疾病嚴重程度、臨床療效和預后的評估[8]。病毒性肺炎起病急、進展迅速、易引發并發癥，尋找有價值的實驗室監測指標用于反映疾病進展和療效，具有十分重要的臨床指導價值。

YKL-40是20年前由JOHANSEN 等[9]發現的一類分泌型糖蛋白，由GHI3L1 基因編碼，屬于GH18殼多糖酶家族成員。與其他GH18 殼多糖酶蛋白分子不同，YKL-40 僅具有殼質的結合位點，不具有殼質酶的生物學活性，反而在氣道炎癥性疾病進程中發揮著重要作用。GOMEZ 等學者[10]發現，YKL-40 在哮喘患者血清中的含量明顯升高，并且與疾病進展有關。JAMES 等學者[11]也發現慢性阻塞性肺疾病患者血清YKL-40含量也大大增加，并且可作為疾病嚴重程度、氣道反應性及氣流限制性的評估指標。YKL-40 具有與細菌甲殼質酶高度同源性的氨基酸序列，可結合細菌的甲殼質酶，降解細菌細胞壁，進而抵御細菌入侵引起炎癥反應[12]。目前臨床關于YKL-40的大多數研究主要是針對細菌感染性炎癥疾病，對病毒性肺炎的研究尚少。YKL-40 屬于炎癥急性期蛋白，主要來自于活化的巨噬細胞和中性粒細胞。本研究發現，病毒性肺炎患兒血清YKL-40含量較健康兒童也明顯增加；而且單純病毒性肺炎患兒血清YKL-40含量與合并細菌感染患兒比較無差異，說明YKL-40 可能不僅與細菌感染有關，而且是肺功能病變過程中的功能性因子。另外，由于YKL-40與C反應蛋白和降鈣素原等因子類似，都屬于非特異性急性時相反應蛋白，在感染早期即迅速升高，當感染被控制后又迅速降低，因此YKL-40 并非是病毒性肺炎的特異性指標，但是在預測其疾病嚴重程度時具有一定的參考價值。

本研究還發現，重癥肺炎患兒血清YKL-40含量升高更明顯，而經抗病毒、抗感染等綜合治療后，治愈和好轉患兒血清YKL-40含量顯著降低，這也間接證實YKL-40 可能通過某些因子的影響，參與肺組織功能損傷。TANG 等[13]發現，YKL-40 可以通過MAPK/NF-κB信號通路促進支氣管上皮細胞表達白細胞介素-6、白細胞介素-8 等促炎因子，并促進支氣管平滑肌細胞的遷移和增殖活性。王定淼等學者[14]也證實，血清和肺泡灌洗液中YKL-40含量與重癥肺炎患者病情嚴重程度密切相關，并且是影響患者預后的獨立危險因素。本研究證實，血清YKL-40與患兒tPTEF/tE 呈負相關。由于很多年齡較小的患兒往往不能配合肺功能檢查，而且很多指標也不完全適用于兒童，因此采用潮氣肺功能檢查患兒tPTEF/tE，tPTEF/tE 也是評估肺功能的良好指標之一。

除此以外，循環miRNA 診斷標志物的篩查和挖掘一直是臨床研究的熱點。一方面循環miRNA 多具有穩定的保守序列，操作方便，敏感性較高；另一方面，從作用網絡分析，多數miRNA 往往是編碼蛋白基因的上游分子，其異常表達出現的時間往往早于蛋白分子，因此筆者通過miWalk、TargetScan6.2、PicTar等數據庫預測miR-24和CHI3L1 具有靶向調控關系。本研究中血清miR-24 mRNA與YKL-40 呈負相關，而且與患兒病情嚴重程度、肺功能及預后也有一定的關系。LIN 等學者[15]通過脂多糖誘導新生大鼠肺損傷實驗證實，血清miR-24 在肺損傷大鼠模型中降低，而上調miR-24的表達可明顯抑制肺部損傷和炎癥因子的分泌，這與本研究結果一致。

綜上所述，基于當前臨床對病毒性肺炎疾病進展、臨床療效的評價主要依靠癥狀學依據，缺乏客觀、量化的標志分子，本實驗通過分析血清miR-24 mRNA和YKL-40 在不同臨床病理特征及治療前后表達水平的變化，證實兩者與兒童病毒性肺炎有一定的聯系。其中，血清miR-24 mRNA與患兒肺功能指標tPTEF/tE 呈正相關，而YKL-40與tPTEF/tE 呈負相關。檢測血清miR-24 mRNA和YKL-40表達水平有助于評估病情和臨床療效，從而為臨床治療提供依據。