慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平及臨床意義

薛立芝，張思泉

（杭州市西溪醫院 1.檢驗科，2.重癥醫學科，浙江 杭州 310023）

乙型肝炎病毒感染在世界范圍內流行，慢性乙型肝炎患者中有約1/3 患者最終會發展為肝硬化或肝細胞癌等嚴重并發癥。我國是乙型肝炎病毒感染率比較高的國家之一，我國≥50%肝癌是由長期慢性乙型肝炎病毒感染所致。慢性乙型肝炎發病機制復雜，表觀遺傳學在慢性乙型肝炎的發病中具有重要作用，DNA甲基化為表觀遺傳學的重要組成部分，為基因轉錄表達的調控方式之一；在慢性乙型肝炎發病中存在DNA 異常甲基化[1]。DNMT1為體細胞內最豐富的甲基轉移酶之一，其具有維持DNA甲基化的作用；DNMT1 異常可導致基因組穩定性下降、原癌基因活性增高、抑癌基因功能喪失，從而在多種疾病及惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[1-2]。

研究發現，原發性肝癌患者肝組織中DNMT1表達升高，肝組織中DNMT1表達與患者乙型肝炎、腫瘤復發和轉移等臨床病理特征關系密切[3]。介于乙型肝炎為肝癌發病的主要原因，DNMT1 在乙型肝炎中的表達及意義值得探討。本文對慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平及其臨床意義進行研究，為臨床治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2019年12月在杭州市西溪醫院就診的慢性乙型肝炎患者120例作為乙型肝炎組，同期120例健康體檢者作為對照組。乙型肝炎組男性71例，女性49例；年齡（46.37±9.61）歲。對照組男性68例，女性52例；年齡（45.93±10.52）歲。納入標準：①乙型肝炎組患者有乙型肝炎病史；②＞6個月乙肝表面抗原陽性史；③對照組肝功能、乙肝兩對半及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA 均正常。排除標準：①自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎等其他肝病；②丙型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎等其他類型肝炎；③并發肝癌，嚴重心、肺、腎等臟器疾病；④惡性腫瘤。本研究通過醫院倫理委員會批準所有患者知情同意參與研究。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 肝臟活檢對慢性乙型肝炎患者進行常規肝臟活檢，參照Metavir評分系統進行肝炎癥程度和肝纖維化程度評估：肝炎活動度為≤G2為輕度炎癥活動，G3及G4為重度炎癥；肝纖維化分期為≤S2 期為輕度肝纖維化，S3 期和S4 期為重度肝纖維化。根據上述評估將慢性乙型肝炎患者分為輕度炎癥組52例和重度炎癥組68例；輕度纖維化組56例和重度纖維化組64例。

1.2.2 各指標測定谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、總膽紅素（total bilirubin,TBIL）、對數乙肝病毒（log hepatitis B virus,Log HBV）由杭州市西溪醫院檢驗科檢驗；血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、DNMT1水平采用ELISA法測定（試劑盒購自美國Sigma公司），具體方法：用純化人TNF-α、DNMT1 抗體包被微孔板，往包被微孔中加入TNF-α、DNMT1，與辣根過氧化物酶標記的TNF-α、DNMT1 抗體結合形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入底物3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺顯色，3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺在辣根過氧化物酶的催化下轉為藍色；在酸的作用下最終轉化為黃色，顏色深淺與TNF-α、DNMT1含量呈正相關。采用酶標儀測定450 nm 波長處光密度值，通過標準曲線計算TNF-α、DNMT1水平。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差 （±s）表示，比較用t檢驗；相關性分析用Pearson 法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組生物化學指標和血清DNMT1水平比較

兩組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α和DNMT1水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），乙型肝炎組高于對照組。見表1。

2.2 乙型肝炎患者血清DNMT1與AST、ALT、TBIL及TNF-α的相關性分析

乙型肝炎患者血清DNMT1水平與AST、ALT、TBIL及TNF-α 呈正相關（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組生物化學指標和血清DNMT1水平比較 （n=120，±s）

表1 兩組生物化學指標和血清DNMT1水平比較 （n=120，±s）

組別 AST/（u/L）ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）TNF-α/（nmol/L）DNMT1/（μg/L）對照組 15.12±2.26 16.34±2.64 8.42±1.05 1.12±0.24 24.46±5.74乙型肝炎組 52.61±2.86 85.31±3.02 20.53±1.22 3.14±0.33 35.71±6.02 t值 112.665 188.353 82.416 54.229 14.816 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 乙型肝炎E抗原陽性組與陰性組生物化學指標和血清DNMT1水平比較

乙型肝炎E抗原（HBeAg）陽性組與HBeAg陰性組AST、ALT、TBIL、TNF-α、Log HBV和DNMT1比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），HBeAg陽性組高于HBeAg陰性組。見表3。

表3 HBeAg陽性組與陰性組生物化學指標和血清DNMT1水平比較 （±s）

表3 HBeAg陽性組與陰性組生物化學指標和血清DNMT1水平比較 （±s）

組別 n AST/（u/L）ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）TNF-α/（nmol/L）Log HBV DNMT1/（μg/L）HBeAg陰性組 71 36.57±2.65 44.12±3.24 19.65±3.71 2.49±0.41 2.77±0.32 31.51±4.32 HBeAg陽性組 49 65.64±3.07 122.61±3.78 21.03±3.87 3.82±0.47 5.64±0.38 44.19±4.18 t值 55.341 121.799 2.110 16.447 44.706 16.023 P值 0.000 0.000 0.037 0.000 0.000 0.000

2.4 HBeAg陽性患者血清DNMT1與AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV的相關性分析

HBeAg陽性患者血清DNMT1水平與AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV 呈正相關（P＜0.05）。見表4。

表4 HBeAg陽性患者血清AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV與DNMT1的相關性

2.5 不同肝組織炎癥程度患者血清DNMT1水平比較

輕度炎癥組與重度炎癥組患者血清DNMT1水平分別為（29.16±3.13）、（40.36±3.21）μg/L，經t檢驗，差異有統計學意義（t=19.145，P=0.000），重度炎癥組高于輕度炎癥組。

2.6 不同肝纖維化程度患者血清DNMT1水平比較

輕度纖維化組與重度纖維化組患者血清DNMT1水平分別為（31.62±3.27）和（39.17±3.38）μg/L，經t檢驗，差異有統計學意義（t=12.394，P=0.000），重度纖維化組高于輕度纖維化組。

3 討論

表觀遺傳指在未改變基因序列的情況下基因表達發生改變，即細胞內遺傳信息外的遺傳物質發生了改變，更重要的是這種遺傳物質的改變在細胞的增殖、生長中可以穩定傳遞給子代[4]。目前發現的非基因序列變化的表觀遺傳分子機制有DNA甲基化、組蛋白質修飾、RNA 干擾及組蛋白乙酰化等[5]。DNA甲基化為表觀遺傳學研究最多的機制之一，在哺乳動物中DNA甲基化主要通過DNMT1、DNMT3 等進行調節[6]。

DNA甲基化為重要的表觀遺傳學修飾形式之一，其中DNMT為催化DNA甲基化的重要調控分子[7]。DNMT 催化DNA甲基化可沉默抑癌基因，從而促進惡性腫瘤的發生、發展，DNMT1為DNMT的一種類型，在多種惡性腫瘤中過表達[8-10]。研究發現，DNMT1 在肝癌中也存在過表達[11]。乙型肝炎病毒感染為肝癌發病的主要原因，DNMT 在乙型肝炎中的作用也受到關注，如LI 等[11]研究發現，肝細胞癌中乙型肝炎病毒感染與DNMT表達關系密切，肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒感染可上調DNMT表達[12]。康艷紅等[13]研究發現，乙型肝炎病毒X 蛋白轉錄激活細胞DNMT 啟動子，進而上調DNMT表達。KOSTYUSHEV 等[14]研究發現，慢性乙型肝炎患者DNMT 過表達。MADEDDU 等[15]研究發現，慢性乙型肝炎患者DNMT1 對線粒體DNA甲基化狀態具有調節作用。上述研究均表明DNMT 參與乙型肝炎的發病過程。

本研究對慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平進行研究，發現乙型肝炎組血清DNMT1水平高于對照組；HBeAg陽性組DNMT1水平高于HBeAg陰性組；慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平與AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV 呈正相關，與肝組織炎癥活動程度和肝纖維化程度關系密切。慢性乙型肝炎患者HBeAg 血清學轉化（即由陽性轉化為陰性）為血清學的轉折點，其轉化提示患者慢性乙型肝炎病程發展緩慢、遠期預后良好及肝硬化發病率降低，患者經過治療后HBeAg 血清學轉化表示抗病毒治療效果良好。AST、ALT、TBIL為肝功能的常用指標，其水平升高表明患者肝功能異常。TNF-α為常用的炎癥指標，其水平升高表明機體炎癥反應程度升高。由此可見，DNMT1 可能參與慢性乙型肝炎的發病過程，血清DNMT1水平在一定程度上可反映患者的肝功能損傷程度、炎癥活動程度和纖維化程度、預后及療效。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平升高，檢測血清DNMT1水平在患者肝功能損傷、炎癥程度、纖維化程度和預后評估中具有一定參考價值。