姜黃素煙酸酯對輻射誘導的巨噬細胞IL-1β、IL-18表達的影響*

（南華大學附屬第二醫院 血管外科，湖南 衡陽 421001）

放療所致頸動脈炎是頭頸惡性腫瘤放療患者卒中新的獨立危險因素。放療會造成照射野內血管損傷，其動脈損傷導致動脈血管狹窄會引起患者出現一過性黑朦、輕癱、感覺障礙等癥狀，嚴重狹窄會增加發生腦血管事件的風險[1-3]。因此，早期減輕放療性頸動脈炎，可減緩頸動脈狹窄發展進程，從而降低腦卒中發生率。放射線對血管內皮損傷致巨噬細胞的活化是放療后動脈炎發生的關鍵因素。研究發現，輻射刺激可誘導巨噬細胞內NLRP3炎癥小體活化，從而促進細胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-18[4]。姜黃素煙酸酯是姜黃素和煙酸兩者結合形成的新型化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調節等諸多藥理作用。研究表明，姜黃素在炎癥疾病中能起到良好的抗炎作用[5-6]。因此，本實驗以巨噬細胞作為模型，通過射線照射巨噬細胞，以姜黃素煙酸酯干預，觀察其對放療后炎癥介質釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

姜黃素煙酸酯由湖南中醫藥大學庹勤慧老師贈送，將其溶于二甲基亞砜 （DMSO） 中，儲液濃度為1.0 μmol/L。實驗所用一抗為多克隆兔抗人白細胞介素-1β （IL-1β） （ab2105） 、兔抗人白細胞介素-18 （IL-18） （ab71495） 、鼠抗人β-actin （ab8227） 購自美國Abcam公司，巨噬細胞 （RAW264.7） 由南華大學附屬第二醫院臨床實驗中心所有，高糖DMEM培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天有限公司，Western blotting 發光液購自北京英格恩生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自廣州七星生物科技有限公司，Siemens Primus 直線加速器購自德國西門子公司，參數設定為6 MVX，吸收劑量為200 Gy/min，源皮距為100 cm。

1.2 方法

1.2.1 照射劑量常規對RAW264.7 細胞進行培養，取對數生長期細胞進行實驗。RAW264.7 細胞的照射劑量為200 Gy/min。將處于對數生長期的RAW264.7 細胞給予不同劑量 （0、2、4和8 Gy） 的照射，照射完畢后，提取細胞總蛋白，應用Western blotting 檢測IL-1β、IL-18的表達。

1.2.2 細胞分組分為空白對照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素煙酸酯不同濃度組 （1.0、3.0和9.0 μmol/L）。空白對照組和單純照射組照射前不給予藥物干預，姜黃素煙酸酯不同濃度組照射前1 h 預先給予不同濃度的姜黃素煙酸酯，照射后24 h提取細胞總蛋白行進一步檢測。

1.2.3 Westernblotting 檢測照射后24 h 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，蛋白定量檢測按BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行操作。取25 mg 蛋白上樣進行SDSPAGE 電泳，80 V 穩壓轉膜，以含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育后，洗膜加入相應辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h，電化學發光 （ECL） 法檢測。以β-actin作為內參。

1.2.4 CCK-8實驗取對數生長期RAW264.7 細胞消化后進行稀釋，并計算濃度，按10 000個/孔細胞接種于64孔板中，每組設置3個復孔。貼壁過夜后去除培養基，加入根據實驗需要配置的梯度濃度姜黃素煙酸酯，每孔100 μl。24 h后，棄培養基，每孔加入新鮮培養基100 μl及CCK-8 試劑10 μl，注意不要留有氣泡。培養板置于細胞培養箱中37℃培養30 min，然后立即取出置于酶標儀，于波長450 nm處檢測吸光度值，以3個復孔平均值作為每個樣本最終結果，實驗重復3次，根據說明書計算生存分數。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差 （±s）表示，比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最適照射劑量

射線照射后內IL-1β、IL-18的蛋白表達水平升高 （見圖1、2）。以0、2、4和8 Gy 劑量放射線照射RAW264.7 細胞后，各組IL-1β的蛋白表達水平分別為 （0.157±0.009） 、 （0.387±0.010） 、 （0.437±0.010）和 （0.396±0.010），經單因素方差分析，差異有統計學意義 （F=436.534，P=0.000）。2、4和8 Gy組分別與0 Gy組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05）。各組IL-18的蛋白表達水平分別為 （0.899±0.004） 、 （1.074±0.044） 、 （1.375±0.038）和 （1.240±0.041），經單因素方差分析，差異有統計學意義 （F=74.762，P=0.000）。2、4和8 Gy組分別與0 Gy組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05）。IL-1β、IL-18表達水平在0～4 Gy 照射劑量范圍隨照射劑量增加而升高，而8 Gy 照射后有所下降，因此4 Gy 是最適照射劑量。

2.2 姜黃素煙酸酯對照射后RAW264.7 細胞IL-1β、IL-18蛋白表達的影響

行CCK-8 實驗檢測姜黃素煙酸酯不同濃度組生存率，結果顯示各組生存率＞80%。見圖3。

圖1 不同劑量放射線照射后RAW264.7 細胞的IL-1β 蛋白表達

圖2 不同劑量放射線照射后RAW264.7 細胞的IL-18蛋白表達

圖3 不同濃度姜黃素煙酸酯對RAW264.7 細胞毒性的影響 （±s）

照射前1 h分別給予1.0、3.0和9.0 μmol/L 姜黃素煙酸酯，再經最適照射劑量4 Gy 照射，24 h后提取蛋白，空白對照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素煙酸酯不同濃度組 （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-1β的蛋白表達水平分別為 （0.244±0.008） 、 （0.580±0.012） 、 （0.419±0.012） 、 （0.333±0.025）和 （0.439±0.003），經單因素方差分析，差異有統計學意義 （F=235.134，P=0.000），各組IL-1β的蛋白表達水平分別與空白對照組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05），各組IL-1β的蛋白表達水平分別與單純照射組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05）。見圖4。

由圖5示：空白對照組 （0.0 μmol/L） 、單純照射組 （Vector） 、姜黃素煙酸酯不同濃度組 （1.0、3.0和9.0 μmol/L） IL-18的蛋白表達的水平分別為 （0.454±0.006） 、 （0.711±0.010） 、 （0.463±0.016） 、 （0.385±0.018） 及 （0.361±0.023），經單因素方差分析，差異有統計學意義 （F=182.243，P=0.000）。各組IL-18的蛋白表達水平分別與空白對照組比較，除1.0 μmol/L組差異無統計學意義 （P＞0.05），其余組差異有統計學意義 （P＜0.05） ；各組IL-18的蛋白表達水平分別與單純照射組比較，差異有統計學意義 （P＜0.05）。

圖4 各組RAW264.7 細胞IL-1β 蛋白的表達

圖5 各組RAW264.7 細胞IL-18蛋白的表達

3 討論

放療引起的血管損傷機制是放射線導致內皮細胞的炎癥反應，釋放炎癥介質導致動脈炎性損傷。抑制巨噬細胞的活化、減少炎癥因子釋放，可減輕放射性動脈損傷，延緩頸動脈狹窄的發生。研究表明抗炎、抗氧化、抗免疫調節是姜黃素諸多藥理作用之一[7]。JAIN 等[8]研究表明，在姜黃素干預后糖尿病大鼠的炎癥因子TNF-α、IL-6表達水平下降。姜黃素的缺點是其體內代謝消除快、生物利用度低，臨床應用受到限制。調節炎癥因子藥物煙酸單用有皮膚潮紅、瘙癢、肝功能損害等副作用。因此，將姜黃素和煙酸兩者結合形成新型化合物姜黃素煙酸酯，可充分發揮煙酸的調節炎癥因子以及姜黃素的抗炎作用，可提高其生物利用度，減輕副反應。因此，本實驗從細胞層面探討姜黃素煙酸酯對炎癥因子IL-1β、IL-18的抑制作用，證明其可作為輻射防護藥物。

本研究結果顯示，巨噬細胞在受到射線照射后，隨著照射劑量的增大，細胞IL-1β、IL-18蛋白的表達升高，于4 Gy 照射劑量時達到峰值，但是當照射劑量達8 Gy時，IL-1β、IL-18的蛋白表達反而下降，究其原因可能為大劑量射線照射時細胞損傷增加，從而影響細胞的活性進而導致IL-1β、IL-18的蛋白表達降低，因此4 Gy 是其最適照射劑量。在4 Gy 射線照射前預先給予不同濃度的姜黃素煙酸酯，隨著姜黃素煙酸酯劑量增加，IL-1β、IL-18的蛋白表達水平降低，提示姜黃素煙酸酯可減少輻射誘導的IL-1β、IL-18的表達，減輕細胞的炎癥反應，對細胞具有保護作用。

本研究中未涉及細胞培養基中分泌型IL-1β、IL-18表達的檢測，這也正是本課題組進一步研究的內容。包括放療前后及姜黃素煙酸酯干預處理后培養基中IL-1β、IL-18表達的變化；同時，可以收集臨床患者接受放療前后的血清，檢測IL-1β、IL-18的表達變化。

綜上所述，研究發現4 Gy 照射巨噬細胞可誘導細胞IL-1β、IL-18的蛋白表達，一定劑量的姜黃素煙酸酯可降低輻射后巨噬細胞IL-1β、IL-18的蛋白表達水平，抑制炎癥反應，具有較好的輻射防護作用。