實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術對痰標本中結核分枝桿菌的診斷價值*

柴國祥，李興芳，韓斌孝，王磊，楊永紅，章國平，牛晨霞

（1.蘭州市肺科醫院，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅省醫學情報研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

肺結核 （pulmonary tuberculosis，PTB） 是由結核分枝桿菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB） 引起的經由呼吸道傳播的傳染病，目前仍然是全球危害最為嚴重的慢性傳染病，尤其是對發展中國家。我國一直以來都是PTB的高負擔國，2018年世界衛生組織發布的報告顯示，中國結核病新發患者約為88.9萬例[1]。因此建立快速準確檢測結核病的方法尤為重要。傳統的羅氏培養法是目前檢驗結核病的金標準，雖然有不同程度的改良，但是檢驗周期過長，操作復雜[2]。噬菌體擴增技術和液體培養技術，雖然都能夠快速檢測，但操作要求高，技術復雜，推廣仍有困難[3-4]。隨著分子生物學技術的發展，基于MTB DNA或RNA的快速檢測技術越來越得到重視，先后出現了以傳統PCR技術為基礎的TB-DNA檢測及以半巢式熒光定量PCR技術為基礎的自動化核酸擴增檢測技術 （Xpert MTB/RIF）。但是兩者的缺陷也很明顯，TB-DNA技術假陽性高，臨床診斷不準確[5-6]；Xpert MTB/RIF 價格昂貴，不適用于基層醫院推廣[7]。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測 （simultaneous amplification and testing，SAT） 技術具有以下幾個特點：①專有的核酸恒溫放大實時熒光檢測體系；②更高的擴增效率 （30 min內擴增10億倍），確保更高的檢測敏感性；③活菌檢測技術。由于RNA 在自然環境中快速降解，在死亡的病原體中幾乎檢測不到RNA，該方法有效地解決PCR技術檢測MTB DNA時導致的假陽性問題[8]。

本研究采用SAT法對疑似結核病患者痰液進行檢測，并與其他檢測方法比較，評價SAT法對MTB的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2018年12月蘭州市肺科醫院收治的PTB患者和同期接受檢查的無證據顯示為PTB患者182例為研究對象。經臨床確診為活動性PTB 115例作為觀察組。其中，男性63例，女性52例；男∶女=1.2∶1.0，平均年齡 （41.6±11.7） 歲。非活動性PTB 67例作為對照組。其中，男性42例，女性25例；男∶女=1.7∶1.0，平均年齡 （44.1±15.3） 歲。兩組性別構成比、年齡比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 儀器與設備

MTB 核酸檢測試劑盒 （RNA 恒溫擴增） （上海仁度生物技術有限公司），MTB rpoB基因和突變檢測試劑盒 （實時熒光PCR法） （美國Cepheid公司），MTB核酸檢測試劑盒 （PCR熒光探針法） （湖南圣湘生物科技有限公司），7300 Real-time PCR System （美國ABI公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 痰標本堿處理將收集的痰標本加入等體積的N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉 （NALC-NaOH） 溶液進行處理，標本離心后，用PBS 洗滌1次，分為5份，分別用于集菌涂片法、羅氏培養法、PCR熒光探針法、Xpert MTB/RIF法及SAT法檢測。

1.3.2 MTB檢測根據《結核病診斷細菌學檢驗規程》[2]進行羅氏培養，以及抗酸染色。集菌涂片法、羅氏培養法、PCR熒光探針法及Xpert MTB/RIF法參考相應的試劑盒使用說明書進行操作。SAT法：將待檢標本置于離心機中13 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入50 ml 裂解緩沖液后重懸，放入超聲清洗器超聲處理15 min，超聲功率為300 W。設置陽性對照為活的H37Ra 菌株，陰性對照為無菌水并與待檢標本同步檢測。其他步驟參考試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

數據分析采用PEMS 3.0 統計軟件，以羅氏培養法為金標準，計算SAT法敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和約登指數。計數資料以例 （%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。以受試者工作特征 （receiver operator characteristic，ROC） 曲線評價Xpert MTB/RIF法和SAT法檢測對MTB的診斷價值。

2 結果

2.1 不同檢測方法檢出MTB 結果比較

不同方法檢測MTB的結果見表1。集菌涂片法與羅氏培養法比較，檢出率低，差異有統計學意義 （χ2=4.966，P=0.026） ；PCR熒光探針法與羅氏培養法比較，差異無統計學意義 （χ2=0.285，P=0.594） ；Xpert MTB/RIF法與羅氏培養法比較，差異無統計學意義 （χ2=0.072，P=0.789） ；SAT法與羅氏培養法比較，差異無統計學意義 （χ2=0.018，P=0.893）。

表1 兩組PTB患者經不同檢測方法檢出痰液中MTB 情況例 （%）

2.2 PCR熒光探針法、Xpert MTB/RIF法和SAT法的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及約登指數比較

以羅氏培養法為標準，PCR熒光探針法的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、約登指數分別為：65.96% （95% CI：51.89%，80.02%），70.59% （95% CI：59.48%，81.70%），60.78% （95% CI：46.92%，74.65%），75.00% （95% CI：64.10%，85.90%）和0.37；Xpert MTB/RIF法以上指標為：91.49% （95% CI：83.21%，99.77%），91.18% （95% CI：84.26%，98.09%），87.76% （95% CI：78.24%，97.27%），93.94% （95% CI：88.03%，99.85%）和0.83；SAT法以上指標為：95.74% （95% CI：89.75%，101.74%），98.53% （95% CI：95.59%，101.46%），97.83% （95% CI：93.45%，102.20%），97.10% （95% CI：93.04%，101.16%）和0.94。見表2。

2.3 Xpert MTB/RIF法和SAT法檢測MTB的可靠性評價

以羅氏培養法為參照，Xpert MTB/RIF法和SAT法的AUC分別為0.925 （95% CI：0.869，0.981）和0.936 （95% CI：0.883，0.990）。SAT法的AUC 略高于Xpert MTB/RIF法。見圖1。

表2 3種檢測方法對115例PTB患者篩檢結果例

圖1 Xpert MTB/RIF法和SAT法檢測MTB的ROC曲線

3 討論

本研究以羅氏培養法為標準，對幾種不同的檢測MTB 方法進行比較。與羅氏培養法的檢出率比較，集菌涂片法檢出率較低，該結果與成松等[9]的研究結果基本一致。PCR熒光探針法是建立在PCR技術上的一種快速檢測MTB技術，是以DNA為檢測靶標，由于DNA 在自然環境中半衰期較長，不容易降解，容易產生污染，導致假陽性的出現。本研究中，PCR熒光探針法檢出率高于羅氏培養法，但是陽性預測值較低，僅為60.78%，假陽性率較高。Xpert MTB/RIF法是由美國Cepheid公司開發一種結核病診斷技術，由于靶點是利福平突變序列，因此可以檢測耐藥性，并且實現診斷過程的自動化，操作簡便，檢驗周期短。本研究中，Xpert MTB/RIF法檢出率與羅氏培養法比較無差異，檢驗效能指標敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、約登指數略低于張燦強等[10]的報道，但趨勢基本一致，可能受到樣本數量，實驗操作等因素的影響。Xpert MTB/RIF法各項檢驗效能指標均優于PCR熒光探針法。SAT法是一種新型核酸檢測技術，該技術采用M-MLV 逆轉錄酶和T7RNA 多聚酶進行核酸擴增，相對于其他核酸擴增技術，反應抑制物更少，有效減少假陰性結果；采用實時熒光閉管檢測，使污染得到有效控制，即使污染產生，由于擴增產物為RNA，環境中極易降解，從而大幅度提高檢測結果的可靠性。其最大的優點在于直接以MTB特異性RNA為擴增靶標，以擴增產物RNA為檢測靶標，由于RNA 僅在活菌中存在，MTB 死亡后RNA 降解，所以該方法可以作為活動性PTB及治療效果的監測[11]。本研究中，SAT法的檢出率略低于羅氏培養法，該結果與FAN 等[12]在2018年的報道基本一致。其陽性預測值高于Xpert MTB/RIF法，提示以RNA為模板的Set-TB 法有效降低假陽性率，其他檢驗效能指標與Xpert MTB/RIF法接近。SAT法各項檢驗效能指標均優于PCR熒光探針法。ROC曲線結果顯示，2種檢測方法的AUC 較大，均＞0.9，表明兩者對MTB的檢測準確性較高，具有較高的診斷價值，并且SAT法的AUC 大于Xpert MTB/RIF法。

綜上所述，SAT法對痰標本中MTB的敏感性、特異性和準確度較高，具有較高的診斷價值，并能有效降低假陽性率，提高檢測效率，操作簡單，檢測周期短，可以作為臨床診斷參考。