透明質酸微陣列結構的構建及其生物相容性研究

常鈴雪， 何宏燕， 金莉莉， 劉昌勝

（華東理工大學材料科學與工程學院，教育部醫用生物材料工程研究中心，上海 200237）

隨著組織工程與再生醫學的發展，模仿細胞外基質的結構、制備仿生微結構引起了科研人員的廣泛關注[1-4]。許多學者致力于研究植入材料的表面特性與細胞的相互作用，通過圖案化表面的可控制備，實現對細胞的形貌、增殖、遷移、分化和基因表達的調控[5]。在骨修復中植入材料表面的微納結構[6]特性（表面紋理、幾何形狀、空間位置和高度）的不同是影響成骨細胞生物學行為的關鍵因素之一，可以調節成骨細胞向特定譜系進行分化，指導干細胞成骨分化和作為支撐結構維持新骨的長入[2,7-9]。Chang 等[10]研究發現骨間充質干細胞（BMSCs）的成骨分化能力在微孔表面上有所提高，微孔表面增強了細胞的黏著斑和肌動蛋白的結合能力。Wang 等[11]證實在深溝槽基底上培養的BMSCs 的成骨分化能力明顯高于淺表面上的成骨分化能力。Dalby等[12]認為納米結構（直徑為120 nm）可以誘導人骨間充質干細胞（hBMSCs）在體外產生骨礦物質和成骨分化。趙等[13]發現微孔和納米管相結合的分級微/拓撲結構對BMSCs 成骨分化能力有著顯著的影響。由此可見，微結構采用的基底材料和結構特性在調控 BMSCs 的生物學響應中尤為重要。然而，這些微結構的基底材料（例如聚二甲基硅氧烷[14]）通常生物活性不足。除了微結構的特性之外，基底材料本身的理化特性對干細胞的影響也不容忽視。為了更好地調節干細胞的生物學行為和滿足骨組織修復的需要，有必要對制備生物活性好、結構精準的微陣列結構用于 BMSCs 的生物學行為進行研究。

透明質酸（HA）作為細胞外基質的基本成分之一，具有良好的親水性和生物活性，在維持細胞外微環境、軟骨修復、傷口愈合等方面有著廣泛的應用[15,16]，尤其是它可以作為藥物的載體以提高藥物的生物利用度。為了得到具有一定機械強度和生物相容性的 HA，本文用己二酸二酰肼（ADH）和N′-（乙基亞胺基亞甲基）-N, N-二甲基-1,3-丙二胺（EDCI）與 HA 交聯成膜。通過調節ADH 和EDCI 的質量分數（8.3%～16.7%），研究不同配比對薄膜的表觀結構、膨脹系數、降解行為以及材料相容性的影響。對反應體系進行配比優化后，選取合適的配比和聚二甲基硅氧烷（PDMS）軟光刻技術進行微陣列結構的精準制備和特性評價。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

HA:純度97%，麥克林公司；己二酸二酰肼:純度＞99.0%，北京伊諾凱科技公司；EDCI:純度97%，上海泰坦科技公司；PDMS:SKYLARD184，道康寧公司；胎牛血清（FBS）、鷹最小基本培養基（MEM）、無鈣鎂改良MEM 培養基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）試劑:美國Gibco 公司；大鼠骨髓間充質干細胞（rBMSCs）:上海斯萊克公司。

1.2 HA 水凝膠的制備

將HA 粉末配成w=0.5% 的HA 水溶液，于4 ℃保存，溶脹1 d 后，將不同量的ADH 緩慢加入HA 溶液，之后加入EDCI 快速攪拌，反應中用0.1 mol/L 的鹽酸維持pH≈4.75；反應后調節體系pH=7.0，將反應產物在0.1 mol/L 的NaCl 溶液中透析1 d，接著用超純水透析2 d。提純后液體直接倒入培養皿中，放入37 ℃恒溫箱內干燥成膜；將HA 干膜浸泡于PBS 緩沖液中2 h，溶脹平衡后放入4 ℃冰箱保存備用。實驗中控制HA、ADH 與EDCI 的質量比（mHA∶mADH∶mEDCI）分別為10∶1∶1、8∶1∶1、6∶1∶1 和4∶1∶1，相應的凝膠樣品分別標記為S1、S2、S3、S4。

1.3 HA 薄膜微陣列結構的制備工藝

HA 薄膜 微陣列結構的制備工藝如圖1 所示。首先采用軟光刻技術制備表面具有微米點陣列的硅片母板，用75%（體積分數）的乙醇溶液超聲清洗干燥后，使用商用SKYLARD184 進行軟刻膠工藝對其進行復制，得到與母板互補的微陣列結構；然后將帶有微陣列結構的PDMS 表面進行等離子親水處理，使得HA 溶液能夠充分潤濕PDMS 表面的微陣列結構，最后通過溶劑揮發成膜法得到帶有微陣列結構的HA 薄膜。

圖1 HA 薄膜微陣列結構的制備工藝Fig.1 Preparation process of HA films with well-defined micropatterned surfaces

1.4 HA 薄膜的理化特性表征

傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）:HA 薄膜在-20 ℃冷凍過夜后進行凍干處理，得到海綿結構的HA 材料，取適量HA 與KBr 充分混合研磨后采取壓片制樣，掃描波長4 000～500 cm-1；場發射掃描電子顯微鏡（日本日立公司，S-4800 型）:HA 薄膜凍干處理后固定于樣品臺表面，噴金處理后，裁剪成4 mm×4 mm 方塊，用導電膠固定于SEM 樣品臺表面，設定時間為60 s 進行噴金，置于樣品倉，設置加速電壓為20 kV；恒溫震蕩箱（常州澳華儀器有限公司，SHA-B 型）及電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，FA2104 型）:將HA 薄膜真空干燥稱重（m0），以1∶10 的質量比將HA 薄膜浸泡于PBS 緩沖液中，置于37 ℃溫和震蕩（80 r/min）3、7、10、14 d 后，將HA 薄膜真空干燥24 h 后稱重（mi），通過計算得到剩余量（R），R 可用來評價凝膠薄膜的降解行為。

倒置生物顯微鏡（上海長方光學儀器公司，XSP-17C 型）:選用直徑10 μm、間距為15 μm 的模板制備了4種配方的HA 薄膜，采用倒置生物顯微鏡對HA 凝膠微結構進行觀察，并用納米測量技術對表面微結構尺寸進行測量。

1.5 細胞生物學性能研究

rBMSCs 細胞提取培養工藝如下:選用4 周齡、無特定病原體（SPF）級80～100 g 的雄性SD 大鼠（上海杰思捷實驗動物有限公司），提取股骨和脛骨細胞。將rBMSCs 添加到FBS（φ=10%）、青霉素/鏈霉素雙抗（φ=1%）的α-MEM 培養基中，接種于25 cm2的細胞培養瓶中，在37 ℃、5% （體積分數）CO2、濕度95%的恒溫培養箱中培養。

對不同交聯度的HA 凝膠進行生物相容性MTT 檢測，每組設置3 個平行樣。具體操作步驟如下:選用rBMSC 為細胞模型，以每孔2×103個的接種密度接種于96 孔板中37 ℃培養24 h 后，加入等量的凝膠樣品（S1～S4）于孔板中繼續培養；在1、3、7 d 后，避光條件下每孔加入30 μL MTT 工作液（5 mg/mL），放入37 ℃培養箱繼續孵育4 h；小心吸去孔板中上層溶液，每孔加入100 μL 二甲亞砜（DMSO），37 ℃恒溫震蕩溶解15 min；使用MK3 酶標儀（Thermo Fisher）在波長492 nm 下測量其透光率（OD）值。MTT 法也用于評級不同微陣列結構表面對rBMSCs 體外增殖的影響，將HA 薄膜平鋪于48 孔板中，每孔加入1×104個細胞，30 min 后每孔加入1 mL 培養基。置于37 ℃恒溫培養箱中培養1、3、7 d 后，進行MTT 測試。

2 結果與討論

2.1 HA 凝膠的FT-IR 分析

圖2 示出了配比不同的HA 凝膠和未交聯HA的紅外光譜。如圖所示，相比于未交聯的HA，交聯HA 在3 402cm-1處 的―OH 伸 縮 振 動 峰 和1 407、1 618 cm-1處羧酸鹽的強特征吸收峰消失，意味著羧酸官能團的消失，即證明了交聯反應的發生；交聯樣品在1 610 cm-1處均出現弱吸收峰，說明生成了―CO―NHR。可見，使用ADH 對HA 進行交聯后，HA 中的羥基和羧酸的羰基吸收峰消失，取而代之的是酰胺吸收峰，表明ADH 的氨基與HA 的羧基生成了酰胺，成功實現了HA 的交聯；隨著ADH 和EDCI 用量的增加，薄膜中酰胺吸收峰逐漸變強，說明 HA 的交聯程度增加。

2.2 HA 薄膜的表面形貌

圖3顯示了HA薄膜的表面形貌。當mHA∶mADH∶mEDCI為10∶1∶1 時，雖然HA 薄膜表面呈現連續結構，但表面粗糙不平；隨著ADH 和EDCI 含量的增加，薄膜表面的粗糙程度降低，當mHA∶mADH∶mEDCI為4∶1∶1 時，HA 薄膜表面局部區域較為光滑，但是表面起伏較大。

圖2 HA 凝膠的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of HA gels

圖3 不同配比的HA 薄膜的表面形貌Fig.3 SEM images of HA films with different reagent ratios

為了觀察HA 凝膠的內部交聯結構，將透析純化后的溶液直接倒入玻璃培養皿，放入-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出再凍干操作24 h 后進行表面形貌觀察（圖4）。如圖所示，4 種HA 交聯凝膠內部呈現多孔結構，其形成原因主要在于凍干過程中凝膠內部的水分升華。當mHA∶mADH∶mEDCI=10∶1∶1 時，樣品的孔徑約為850 μm，孔洞較為松散；隨著ADH 和EDCI 用量的增加，凝膠內部的孔洞直徑逐漸變小，孔洞結構越來越緊密；當mHA∶mADH∶mEDCI=4∶1∶1 時，相較于其他凝膠，樣品內部孔徑最小，橢圓形長徑約為350 μm，孔洞結構最為緊密。可見，ADH 和EDCI 用量的增加提高了HA 的交聯程度，內部孔徑變小，結構趨向緊密，這與HA 交聯薄膜表面的展示結果相符。材料內部的孔徑結構也會影響HA 凝膠薄膜的膨脹特性，為了得到尺寸可控的HA 微陣列結構，非常有必要對薄膜的膨脹特性進行評價。

圖4 不同配比的HA 凝膠內部結構的SEM 圖Fig.4 SEM images of internal structures of HA gels with different reagent ratios

綜上所述，隨著ADH 和EDCI 用量的增加，交聯程度增加，凝膠內部孔徑有著逐漸變小的趨勢，結構更加緊密。由此可以推斷，當凝膠溶脹平衡后，材料的膨脹程度不同，孔徑較小的HA 薄膜將會有較小的體積膨脹系數，制成的微陣列結構在溶脹平衡后也沒有明顯的變形和損壞。

2.3 HA 薄膜的降解行為

圖5 示出了HA 薄膜的降解曲線，所有樣品均表現出比較穩定的降解速率。隨著ADH 和EDCI 用量的增加，薄膜的交聯程度增加，材料的孔徑變小，降解速率隨之減慢。14 d 時，mHA∶mADH∶mEDCI為10∶1∶1 的薄膜幾乎全部降解，mHA∶mADH∶mEDCI為4∶1∶1 的薄膜僅降解了約30%。由此可見，通過改變HA 薄膜的交聯程度可以有效地調控薄膜的降解行為。

2.4 HA 凝膠的生物相容性評價

實驗樣品分為5 組，不同配比的HA 凝膠的生物活性示于圖6。隨著ADH 和EDCI 用量的增加，細胞活性有所降低。雖然各組樣品的細胞總數均低于空白對照組（Control），但仍具有較好的細胞活性，HA 凝膠本身未表現出顯著的細胞毒性，故均可用于之后的細胞實驗。

圖5 不同配比的HA 薄膜的降解行為Fig.5 Degradation of HA films with different reagent ratios

圖6 不同配比的HA 凝膠的細胞活性Fig.6 Cell viability of HA gels with different reagent ratios

2.5 表面具有微孔結構的HA 薄膜的制備與評價

硅模板的表面設計:4 種不同尺寸的微孔結構，孔徑（d）分別為10、30、40、100 μm，相應微孔結構的間距（w）分別為15、10、40、20 μm，深度均為20 μm。HA 薄膜表面形貌如圖7 所示。HA 薄膜表面具有與硅片母板表面相同的微孔結構，但由于模板的復制操作誤差和材料特性，最后制作完成得到的HA 薄膜表面結構可能會發生變化。由于在制樣過程中，薄膜表面微結構并非肉眼可見，截面脆斷時無法保證斷裂面全部為凹槽直徑部位，所以斷面圖只用來觀測凹槽深度，并不用來測量直徑及凹槽間距。

以圖7（d）圖案為例，比較ADH-HA 干膜表面與硅設計模板、PDMS 模板的微孔結構差異。硅設計模板的孔徑為100 μm、間距為20 μm、深度為20 μm，復制后PDMS 的間距略有減小（15 μm），孔徑和深度基本維持不變（參見圖8）。HA 干膜的圓柱凹槽直徑和凹槽之間的間距與硅片母板沒有顯著差異，但凹槽深度僅為5 μm。這是因為HA 交聯溶液具有較大的黏度，用等離子體對PDMS 表面進行處理，盡管HA 溶液完全浸入PDMS 表面微結構當中，制得的HA 薄膜失水凍干后用于SEM 觀察，凍干制樣過程對其結構有重要的影響，尤其是厚度方向，因此，HA 干膜的凹槽深度僅為5 μm 左右。

HA 干膜溶脹后，不同交聯程度的HA 薄膜的表觀形貌和溶脹系數如圖9 所示，所用的PDMS 子板圖案為孔徑10 μm、間距15 μm。如圖9（a）所示，HA 干膜的孔徑約為10 μm，隨著ADH 與EDCI 含量的減少，溶脹后微孔的直徑逐漸增大，S4、S3、S2 的孔徑分別為32、40、50 μm，S1 甚至變形到在顯微鏡下幾乎觀測不到微孔結構。圖9（b）中的相對直徑比更為直觀地證實了交聯劑含量對HA 薄膜溶脹特性的影響規律:交聯劑含量越少，交聯程度越小，微孔的變形越大，HA 凝膠的膨脹系數越大。為了構建變形小的微米圖案，選用S4 用于不同微孔結構的制備。

圖7 HA 薄膜表面的不同尺寸微孔結構的SEM 圖:（a）孔徑30 μm、間距10 μm，（b）孔徑40 μm、間距40 μm，（c）孔徑10 μm、間距15 μm，（d）孔徑100 μm、間距20 μm，（e）c 圖案的截面圖，（f）d 圖案的斷面圖Fig.7 SEM images of microwells structure on HA films with different dimensions: （a） d=30 μm、w=10 μm, （b） d=40 μm、w=40 μm,（c） d=10 μm、w=15 μm, （d） d=100 μm、w=20 μm, （e） & （f） are section structures of （c） & （d）

圖8 PDMS 微結構的SEM 圖片Fig.8 SEM images of PDMS microstructures

2.6 HA 薄膜表面的微孔結構對細胞增殖的影響

為了研究表面微結構尺寸和圖案對成骨細胞的生物學行為的影響，選取了尺寸不同、圖案密度不同的4組樣品（樣品 A: 孔徑96 μm、間距32 μm；樣品 B: 孔徑128 μm、間距128 μm；樣品 C: 孔徑32 μm、間距48 μm；樣品 D: 孔徑320 μm、間距64 μm）進行研究，以未圖案化的HA 平膜（Flat）作為參比樣品，選用rBMSC 為細胞模型，通過MTT 法對細胞活性進行了測定（圖10）。

MTT 實驗結果表明，各組微結構材料表面的細胞總數均不低于對照組。與未圖案化的HA 薄膜表面相比，隨著凹槽直徑的減小，細胞增殖能力呈現上升趨勢。小尺寸HA 薄膜（樣品 C）表面細胞活性最大，說明小尺度的凹槽結構對細胞增殖有著顯著的促進作用。令人意外的是，具有較大微米尺寸的樣品 B 相比于樣品A，也有著較好地促進細胞增殖能力，這可能與rBMSCs細胞鋪展后的直徑有關（一般為120 μm 左右），與樣品B 的微圖案直徑相近。

2.7 ADH-HA 微結構表面的骨誘導性堿性磷酸酶（ALP）活性比較

本實驗測定rBMSC 在一系列不同微結構ADH-HA 薄膜上的ALP 活性，以評價微結構對成骨誘導能力的影響。

圖9 HA 薄膜在PBS 溶液中（a）溶脹結構觀察和（b）溶脹系數Fig.9 Swelling properties of HA films with well-defined microstructure （a） observed by microscopy and （b） swelling coefficient

如圖11 所示，使用總蛋白量進行均一化后，不同天數各組薄膜上的細胞ALP 活性趨勢大致相近。與未圖案化的 HA 薄膜相比，隨著圓形凹槽直徑的減小，細胞ALP 活性水平逐漸上升。rBMSCs 在小微米結構（d=32 μm）ADH-HA 薄膜上有著更高的成骨ALP 活性；其他3 組微米結構表面的rBMSCs 的成骨活性略有提高。

圖10 微陣列結構對rBMSCs 細胞活性的影響:（A）孔徑96 μm、間距32 μm；（B）孔徑128 μm、間距128 μm；（C）孔 徑32 μm、間 距48 μm；（D）孔 徑320 μm、間 距64 μmFig.10 Effect of cell viability of rBMSCs on the microstructures with different dimensions: （A） d=96 μm、w=32 μm; （B）d=128 μm、w=128 μm; （C） d=32 μm、w=48 μm; （D）d=320 μm、w=64 μm

圖11 微陣列結構對rBMSCs 的ALP 活性影響:（A）孔徑96 μm、間距32 μm；（B）孔徑128 μm、間距128 μm；（C）孔徑32 μm、間距48 μm；（D）孔徑320 μm、間距64 μmFig.11 Effect of ALP activities of rBMSCs cultured on different microstructure systems: （A） d=96 μm、w=32 μm; （B）d=128 μm、w=128 μm; （C） d=32 μm、w=48 μm; （D）d=320 μm、w=64 μm

3 結 論

（1）選用可降解高分子HA 作為基底材料，采用交聯劑ADH 和EDCI 成功地交聯成膜。

（2）利用PDMS 軟刻膠技術和溶劑揮發法制備了表面具有微陣列結構的HA 凝膠薄膜，微陣列結構完整、均勻，微米結構精準、可控。

（3）與平滑的HA 薄膜相比，尺寸較大的微米圖案對細胞的增殖沒有顯著影響，而尺寸較小的微米結構（d=32 μm）可以明顯促進rBMSCs 的增殖。

（4）與其他尺寸圖案相比，rBMSCs 在小微米結構（d=32 μm）ADH-HA 薄膜上具有更高的成骨ALP 活性。

（5）材料的仿生特征和優異的理化性質在刺激細胞行為和引導組織再生方面發揮著關鍵作用，然而，表面微結構形貌引導的骨間充質干細胞分化的潛在機制仍不夠明確，材料特性/微陣列結構與細胞生物學的關系尚需進一步探索。