細香蔥種質資源花粉活力及測定方法的比較

郭元元，張 力，蔣月喜，陳振東，黃如葵，宋煥忠，車江旅，吳永升，陳 琴，零 活，張云蕓

（1.廣西壯族自治區農業科學院蔬菜研究所 南寧 530007； 2.廣西壯族自治區蔬菜育種與新技術研究重點實驗室南寧 530007； 3.廣西壯族自治區農業科學院 南寧 530007）

細香蔥（Allium schoenoprasum）又名香蔥、小蔥，是百合科（Liliaceae）蔥屬多年生簇生草本植物，以嫩葉和假莖供食，味辛香、性溫，具有殺菌、解熱、通便、助消化、預防感冒等功效，是一種鮮食加工兼用的調味香料蔬菜[1-2]。廣西壯族自治區地處熱帶亞熱帶，熱量豐富、雨水豐沛，適宜香蔥生長。廣西細香蔥規模化種植歷史悠久。目前年均區內種植面積約2 萬hm2（集中于南寧市、柳江市、百色市、桂林市、玉林市等地），產值超過100 億元，產業基礎優勢突出，在廣西蔬菜周年生產供應中占一席之地，也成為廣西“南菜北運”和“西菜東運”的特色蔬菜種類之一[3-4]。以地方種質資源為基礎而形成的‘柳江細蔥’‘鐘山撒子蔥’‘桂林矮婆娘’‘玉林紅蔥’‘靈川靈香1 號’‘靈川靈香2 號’等[5-6]品種的品質優異、葉綠油韌、蔥白緊實，氣味濃郁，深受群眾歡迎，為當地農村經濟發展、農民增收做出了重大貢獻。生產上細香蔥多為無性繁殖，長期栽培過程中種質不斷退化。在眾多育種方法中，雜交育種是最基本最常用也是最有成效的方法，對蔥屬作物原始材料創新的作用巨大[7-8]。花粉是植物的雄配子體，在植物的有性繁育過程中發揮著重要作用。父本具有良好的花粉活力是成功進行雜交育種的重要條件[9]。在授粉之前檢驗花粉的生活力，以確定花粉發芽的可靠程度，這對繁殖效率提高及有效實施雜交育種具有重要意義。為了合理利用細香蔥種質資源，挖掘與創新香蔥品種，開展細香蔥育種研究勢在必行。在蔥屬花粉活力測定方面，曾有采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法、聯苯胺染色法、四甲基偶氮唑（MTT）法、碘－碘化鉀法、花粉離體萌發法等對蔥屬韭蔥、高葶韭、韭菜及百合等其他作物的花粉活力進行測定報道[10-13]，而細香蔥花粉萌發方面鮮見報道。筆者以細香蔥花粉為材料，采用蔥屬其他作物中花粉活力測定最常用的TTC 染色法、聯苯胺染色法、花粉離體萌發法進行不同花粉活力測定方法比較，以期篩選出適宜的簡單快速測定方法，并采用該方法對不同細香蔥種質資源的花粉活力進行測定，為香蔥種質的有效利用和育種工作提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗設計

試驗于2019 年3 月在廣西壯族自治區農業科學院蔬菜研究所中試基地香蔥資源圃及廣西蔬菜育種與新技術研究重點實驗室開展。

選取從各地收集的香蔥地方種質資源為試驗對象（表1），于設施大棚中栽培，畦寬1.5 m 包溝，溝寬30 cm，高25～30 cm。田間小區采用隨機區組設計，每份種質3 次重復，每重復小區面積12 m2。所有細香蔥種質同時移栽定植，株行距20 cm×15 cm，每穴5 個分蘗，期間統一正常水肥管理，定期觀察記錄田間數據并整理。開花期間，于晴天10：00 采集細香蔥花序，將花序放在培養皿內收集新鮮花粉，測定花粉活力。

1.2 方法

1.2.1 不同檢測方法對花粉活力測定的比較 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法[9]：隨機選取AF13、AF14、AF93 少量花粉放在載玻片上，加1～2 滴TTC 溶液，蓋上蓋玻片后將制完的片子放入培養皿內，置于35 ℃光照培養箱內暗培養，20 min后進行鏡檢觀察花粉染色情況。染成紅色的花粉活力較強，無色為不具有活力的花粉。

表1 香蔥地方種質資源及來源

聯苯胺染色法[14]：隨機選取AF13、AF14、AF93少量花粉放在載玻片上，花粉上滴1 滴混合液（0.20%聯苯胺溶于50%酒精溶液、0.15%α-萘酚溶于50%酒精溶液、0.25%碳酸鈉溶液為1∶1∶1 混合）和1 滴0.3%過氧化氫溶液，充分混合，經過3～4 min后，在顯微鏡下檢查被染色和未染色的花粉粒數。生活力愈強的花粉染色紅色愈深，不具生活力的花粉則呈黃色和無色。

花粉離體萌發法[12]：配置培養基（含10%蔗糖、0.1%硼酸、0.1 g·L-1瓊脂），用玻棒將冷卻前（約50 ℃）的培養基滴入凹玻片的凹孔中（1～2 滴），隨機選取AF13、AF14、AF93 少量花粉，將花粉置于培養液中，在25 ℃條件下光照培養4 h，顯微鏡下檢測花粉萌發情況。

1.2.2 不同香蔥種質資源花粉活力的比較 采用篩選出的快速檢測方法，對29 份細香蔥種質資源進行花粉活力鑒定。

1.2.3 鏡檢結果統計方法 以上每份種質（處理）設3 次重復，每個重復觀察5 個視野，每個視野不少于100 粒花粉，統計花粉活力。花粉活力/%=花粉染色或萌發總數/觀察花粉總數×100。

1.2.4 數據處理 采用Microsoft Excel 2009 軟件對數據進行預處理，采用SPSS 19.0 以及GraphPad Prism 6 對數據進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同檢測方法對花粉活力測定的比較

采用TTC 染色法、聯苯胺染色法和花粉離體萌發法對3 個品種的細香蔥花粉活力進行測定（圖1），結果顯示同一種質花粉的活力（萌發率）或是平均花粉活力（萌發率）從高到低依次為聯苯胺染色法＞TTC 染色法＞花粉離體萌發法（表2）。采用TTC 染色法和離體萌發法測定花粉活力的結果不穩定。采用離體萌發法耗時較長，且萌發結果不明顯。采用聯苯胺染色法操作簡便，耗時較少，反應3～4 min 后即可觀察，顯色較好，大部分花粉活力顯示均達到60%以上（圖1）。

表2 不同檢測方法對3 個香蔥種質的花粉活力測定結果

圖1 不同檢測方法對花粉活力測定的比較

2.2 不同細香蔥種質的花粉活力比較情況

采用聯苯胺染色法測定基地中29 個細香蔥種質的花粉活力（表3）。結果發現，29 個細香蔥種質中AF14‘四季香蔥’測定的花粉活力最高，為80.20%；其次為AF93‘扶照蔥’78.35%，再次為‘老口蔥’76.41%。測定花粉活力最低的為AF57‘香蔥’16.62%。

3 討 論

3.1 花粉活力測定方法的比較

雖然前人研究大多認為離體萌發法測定數據準確、結果真實，但是由于花粉萌發過程中的培養條件（蔗糖、硼酸及溫度）對花粉萌發有一定影響，因此需要根據不同的植物進行培養基、培養時間和溫度等條件的前期摸索，時間消耗相對過長。筆者采用的是高葶韭的離體萌發法配方，發現采用該方法的細香蔥花粉萌發率不高，并且操作起來較繁瑣，結果與郝瑞娟等[15]相同。相對于離體萌發法，染色法測定花粉活力具有簡單和快捷的優點，但由于受花粉特性影響，不同植物花粉適宜的染色方法不同，如高葶韭的花粉活力適宜聯苯胺和離體萌發法[12]、柳樹適宜藍墨水染色法[16]、茶樹花粉適宜離體萌發法和TTC 染色法[17]。在本試驗中，TTC 法測定的細香蔥花粉活力較低，可能由于花粉外壁太厚或花粉內含物中支鏈淀粉含量太少等原因，染色結果不佳，這與汪妮等[18]結果相似。聯苯胺染色法結果操作簡單，是測定細香蔥花粉活力最適宜的方法。

3.2 花粉活力與花粉萌發

在試驗之后，筆者進行了種子收獲情況、質量的調查。發現大部分細香蔥可以收到種子，小部分種質自交沒有種子。出現了部分花粉活力較高的細香蔥種質未收獲種子，部分活力較低的細香蔥種質也可以收到種子，但是收種數量不多的情況。這可能與花粉受精過程復雜、花粉活力只是花粉萌發的必備條件之一有關。花粉萌發除與本身內在因素有關，還受許多外在環境及條件影響，柱頭可授性、花朵的開放期、柱頭分泌物，以及外界環境、溫度、營養條件等均能影響授粉成功率。傳粉是種子植物受精的必經階段，其過程始于花藥開裂和成熟花粉的散出，攜帶著雄配子或其前體的花粉粒被暴露在干燥條件下，必須在具有活力時到達適宜的接受柱頭。因此，花粉的活力與壽命、柱頭的可授性便成為傳粉生態學所必須研究的內容。前人研究表明野生蔥屬植物在高溫、多風及干燥等氣候特征的荒漠草原上生長時，8 h 后花粉基本失去活力，并且柱頭只在開花后2 d 內具有較強可授性，可授性能持續5 d[11]。下一步可將針對細香蔥柱頭的可授性、細香蔥花粉保存等內容繼續開展香蔥種質創制的基礎工作。

表3 不同細香蔥種質的花粉活力測定結果

4 結 論

在TTC 染色法、聯苯胺染色法、離體萌發法中，采用聯苯胺染色法對細香蔥花粉活力進行測定快速準確，可作為細香蔥花粉活力快速測定的最佳方法。29 份細香蔥種質中AF14 花粉活力最高，其次為AF93 和AF94，種質間花粉活力存在顯著差異，可參考用于種質配組及創制工作。