河南華溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因部分序列的克隆及表達特征

劉俊卿，孫 敏，王 蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

nanos基因編碼的高度保守RNA結(jié)合蛋白，最初在果蠅(Drosophilidae)中被鑒定為前后極形成所必需的翻譯阻遏物，對維持生殖細胞的存活起重要作用[1]。該蛋白具有兩個保守的Cys-Cys-His-Cys鋅指基序(CCHC)，并且CCHC基序的每個氨基酸對于果蠅中的nanos基因功能都是必不可少的[2]。研究表明，果蠅nanos基因在介導(dǎo)腹部形成、原始生殖細胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的特化和遷移以及生殖干細胞的維持等方面發(fā)揮重要作用[3,4]。此外，在人(Homosapiens)[5]、線蟲(CaenorhabditisElegans)[6]、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]、小鼠(Musmusculus)[9]、中華鱘(Acipensesinensis)[10]和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]等物種中均有nanos同源基因的報道，且在同一物種中也存在nanos基因的同源基因。但是nanos基因的功能研究目前僅局限于模式生物，甲殼動物中nanos基因及其同源基因的生物學(xué)功能鮮有報道。研究顯示，nanos基因有3個同源基因，分別為nanos1、nanos2和nanos3，小鼠nanos2和nanos3基因均在原始生殖細胞和未分化的精原細胞中表達[12]。斑馬魚對于原始生殖細胞的形成和遷移以及卵母細胞的產(chǎn)生和維持起非常重要的作用[13]。

Yin等[14]研究發(fā)現(xiàn)piwi基因首次出現(xiàn)在果蠅卵巢中，果蠅piwi基因突變會引起生殖干細胞分裂失調(diào)，從而導(dǎo)致不育[15]。piwi基因編碼一種高度堿性的蛋白，該蛋白具有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座子沉默及翻譯抑制的功能，可通過與精子發(fā)生相關(guān)的小RNA相互作用調(diào)控基因表達[16]。目前為止，甲殼動物中piwi基因僅在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[17]、中華絨螯蟹[11]中有報道，其基因表達模式和功能仍待研究。

nanos基因是構(gòu)成性腺P顆粒關(guān)鍵的組成成分，nanos基因缺失，導(dǎo)致生殖干細胞遷移的失敗[18]。piwi基因參與干細胞的自我調(diào)控，在生殖干細胞的維持和生殖細胞的分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用。因此，本研究選取了生殖基因nanos1、nanos2和piwi進行研究，為甲殼動物的生殖調(diào)控研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用到的河南華溪蟹均購自山西省太原市五龍口水產(chǎn)市場，于實驗室馴養(yǎng)兩周。挑選肢體完整、體重為(20±3)g、頭胸甲長寬為(3.4±0.2)cm的雌、雄河南華溪蟹。解剖并迅速取出卵巢、精巢、副性腺、鰓、心、肝胰腺、腸、胃、肌肉等組織；將組織放入用 DEPC 水處理的凍存管中，迅速投入液氮速凍半小時以上，于-80 ℃保存。

1.2 組織總 RNA 的提取

取河南華溪蟹各組織，用 RNAiso Plus(Takara)試劑提取總RNA并溶于RNase-free水中；用微量分光光度計(Biospectrometer)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度及純度；檢測完整的RNA用于cDNA模板的制備。

1.3 基因的克隆

根據(jù)卵巢組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果挑選出nanos1、nanos2、piwi基因的序列，利用Primer 5.0設(shè)計引物(表1)。以河南華溪蟹卵巢組織cDNA為模板，使用 2×Es Taq SuperMix(康為世紀)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。三個基因的退火溫度和延伸時間分別為nanos1：49 ℃，1.5 min；nanos2：50 ℃，15 s；piwi：60 ℃，2 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 本試驗所使用的引物序列

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Sangon Biotech)回收純化后，與克隆載體T-Vector pMD 19(Simple)(Takara)4 ℃過夜連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑取單克隆、測序及序列拼接后得出基因的部分cDNA片段。

1.4 nanos1、nanos2和piwi基因系統(tǒng)進化分析

將得到的nanos1、nanos2和piwicDNA序列使用SnapGene 軟件翻譯成氨基酸序列，在NCBI上進行同源檢索。運用MEGA6.0軟件對檢索到的同源序列分別構(gòu)建三個基因的NJ(Neighbor-joining方法)系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

表2 河南華溪蟹Nanos和PIWI其它物種的氨基酸序列GenBank登錄號

1.5 河南華溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因在不同組織和不同發(fā)育時期卵巢中的表達分析

以rpl38基因作為內(nèi)參(擴增長度為104 bp)[22]，采用半定量PCR方法檢測河南華溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因在體內(nèi)不同組織和不同發(fā)育時期卵巢中的表達情況。分別以卵巢、精巢、副性腺、鰓、心、肝胰腺、腸、胃、肌肉組織cDNA為模板，和以增殖期、小生長期、大生長期、成熟期的卵巢cDNA為模板，以nanos1-F/R、nanos1-F/R、piwi-F/R和rpl38-F/R為引物，使用2×Es Taq SuperMix進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 河南華溪蟹 nanos1、nanos2、piwi基因部分片段的獲得

根據(jù)河南華溪蟹卵巢轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用Primer 5.0設(shè)計nanos1、nanos2、piwi基因的特異引物，通過PCR擴增分別得到1 182 bp、243 bp、1 951 bp的DNA片段(圖1)，經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑取單克隆進行測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析，確定獲得了河南華溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的部分cDNA序列(即基因的保守域序列的獲得)。

圖1 河南華溪蟹nanos1、nanos2和 piwi基因的克隆

2.2 河南華溪蟹nanos1、nanos2、PIWI氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

系統(tǒng)進化樹結(jié)果如圖2顯示，12個不同物種的Nanos分別聚為兩個類群。河南華溪蟹nanos1與nanos2均與中華絨螯蟹親緣關(guān)系最近，且nanos1與中華絨螯蟹聚為一支，其次為凡納濱對蝦和美洲鉤蝦，與濕木白蟻、白鰭豚、中國地鼠、長爪沙鼠、褐家鼠處于同一個類群；與果蠅、黑腹果蠅、斑馬魚、金魚等處于兩個類群，親緣關(guān)系較遠。圖3表明，河南華溪蟹PIWI與三疣梭子蟹和斑節(jié)對蝦PIWI蛋白聚為一小支，而中華絨螯蟹和魚類PIWI單獨聚為一支，說明河南華溪蟹PIWI與三疣梭子蟹和斑節(jié)對蝦的同源性最高，親緣關(guān)系最近，與中華絨螯蟹親緣關(guān)系較遠。

圖2 nanos1和nanos2分子系統(tǒng)進化樹

圖3 PIWI分子系統(tǒng)進化樹

2.3 河南華溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的組織特異性表達

利用SqRT-PCR檢測nanos1、nanos2和piwi基因在河南華溪蟹不同組織中的表達情況(圖4 A)。結(jié)果顯示，nanos1基因在卵巢、精巢、鰓、心和肌肉中均有表達(圖4 A和B)；nanos2基因在卵巢、精巢、副性腺、心臟、腸和肌肉中均有表達，且卵巢中表達量比精巢中表達量高，副性腺中表達量較低(圖4 A和C)；piwi基因特異表達于卵巢和精巢中(圖4 A和D)。由圖4可知，nanos1、nanos2、piwi基因均在卵巢組織中高豐度表達。

圖4 河南華溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的組織特異性表達和灰度分析

2.4 nanos1、nanos2、piwi基因在卵巢發(fā)育過程中的表達特征

為確定nanos1、nanos2、piwi基因在不同發(fā)育時期卵巢中[23]的表達情況，本研究利用SqRT-PCR對三個基因的表達時序進行了檢測。結(jié)果如圖5所示，在卵巢發(fā)育過程中nanos1基因表達量從增殖期、小生長期、大生長期到成熟期呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，在成熟期表達量最高(圖5 A)；nanos2和piwi基因隨著卵巢的發(fā)育表達量逐漸降低，在成熟期卵巢中表達量最低(圖5 B和5 C)。

3 討論

生殖調(diào)控基因nanos1、nanos2和piwi對于河南華溪蟹生殖細胞的發(fā)育是必不可少的。nanos1、nanos2和piwi均是母源因子，在生殖細胞中均有表達，在生殖細胞分化、遷移、生存和維持過程中起關(guān)鍵作用。nanos1、nanos2和piwi表達量的改變會影響PGCs的數(shù)量、分布和遷移，從而導(dǎo)致生殖毒性[24]。

nanos基因?qū)ι臣毎倪w移和分化起關(guān)鍵調(diào)控作用，在不同物種中其同源基因存在功能的分化。研究表明，小鼠nanos1基因在胚胎、成體睪丸和腦組織中均有表達，而nanos2基因為生殖細胞所特有[25]；紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)基因組中存在3種nanos同源基因，其中nanos1基因僅在卵巢中表達，nanos2和nanos3基因在小微絲粒(sMics)中積累[26]，盡管表達分布不同，但都對生殖細胞的遷移和分化起至關(guān)重要的作用[27]；人nanos1基因在許多組織中均有表達，但nanos2基因特異表達于卵巢和精巢[25]，且nanos1基因與pumilio基因形成了復(fù)合體，對生殖細胞發(fā)育過程中特定mRNAs的翻譯抑制起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，河南華溪蟹nanos1 和nanos2基因除分布于卵巢和精巢中，還分布于其它組織中，且均在卵巢中高豐度表達。與之相似，中華絨螯蟹nanos基因在卵巢、精巢、血液、肌肉、心臟、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、肝胰腺和腸中均有表達，其中血液中表達量最低，性腺中表達量最高[17]。因此，推測甲殼動物中不同的表達譜可能發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

piwi基因參與干細胞的自我調(diào)控，在生殖干細胞的維持和生殖細胞的分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用。研究表明，哺乳動物中piwi基因僅在精巢中特異性表達，斑馬魚piwi基因特異表達于卵巢和精巢[28]，本研究發(fā)現(xiàn)在直接發(fā)育的河南華溪蟹中，piwi基因也特異表達于卵巢和精巢組織。與之不同的是，在間接發(fā)育的中華絨螯蟹中，piwi基因在各組織中均有表達，其中在卵巢中的表達量最高，其次為精巢，肝胰腺的表達量最少[17]，推測piwi基因可能在甲殼動物直接發(fā)育和間接發(fā)育的調(diào)控過程中發(fā)揮不同的作用。

此外，卵巢發(fā)育時序結(jié)果表明，nanos1、nanos2和piwi基因的表達貫穿了整個河南華溪蟹的生殖發(fā)育過程，表明了它們對卵巢發(fā)育起重要調(diào)控作用，和nanos1相比nanos2，piwi基因的表達與其相反，隨著卵巢的發(fā)育，表達量逐漸降低，這種現(xiàn)象可能與河南華溪蟹生殖發(fā)育的特殊性相關(guān)。