拉薩裂腹魚(yú)人工繁殖初探

曾本和，楊瑞斌，劉海平，王 建，徐兆利，何林強(qiáng)，曾小理，趙天一，林少卿

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，拉薩 850002；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；3.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223；5.西藏自治區(qū)畜牧總站，拉薩 850000)

拉薩裂腹魚(yú)(Schizothoraxwaltoni)俗稱(chēng)拉薩弓魚(yú)、貝氏裂腹魚(yú)、尖嘴魚(yú)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚(yú)亞科(Schizothoracinae)裂腹魚(yú)屬(Schizothorax)，僅分布于西藏地區(qū)雅魯藏布江中上游干、支流及附屬水體，資源量少，生長(zhǎng)速度緩慢，性成熟年齡較遲，為我國(guó)的特有種，也是西藏地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一[1]。近幾十年以來(lái)，由于水電水利設(shè)施的興建[2]、外來(lái)魚(yú)類(lèi)入侵[3]、過(guò)度捕撈[4]、水質(zhì)環(huán)境惡化[2]，拉薩裂腹魚(yú)被《中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄》列為易危魚(yú)類(lèi)(VU)[5]。因此，研究并保護(hù)拉薩腹魚(yú)資源迫在眉睫。

目前有關(guān)拉薩裂腹魚(yú)的研究資料較少，僅見(jiàn)于其分類(lèi)學(xué)[6-7]、起源和演化[6,8]。近幾年，對(duì)拉薩裂腹魚(yú)的研究開(kāi)始增多，但也只是集中在分子系統(tǒng)發(fā)育與生物地理學(xué)[9-10]、年齡與生長(zhǎng)[11]、食性組成[12]和人工馴養(yǎng)[13-15]，有關(guān)拉薩裂腹魚(yú)人工繁殖研究幾近空白。為保護(hù)和利用拉薩裂腹魚(yú)資源，本試驗(yàn)研究了拉薩裂腹魚(yú)人工繁殖方面的參數(shù)，旨在積累拉薩裂腹魚(yú)的繁殖生物學(xué)方面的基礎(chǔ)資料，為完善人工繁育技術(shù)、實(shí)施增殖放流奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 親魚(yú)來(lái)源及暫養(yǎng)

2019年4月，從雅魯藏布江拉薩至日喀則江段及拉薩河收集野生親魚(yú)4批，總計(jì)376尾，其中雌性203尾。暫養(yǎng)于西藏土著魚(yú)類(lèi)增殖育種場(chǎng)，暫養(yǎng)池為長(zhǎng)4 m×寬3 m×深0.5 m的室內(nèi)水泥池，進(jìn)水口流速0.4 m/s，24 h增氧，流水刺激。檢查雌魚(yú)，挑選出能直接擠卵的60組，直接人工授精，雌雄比1 ∶1。能用于催產(chǎn)的親本83組，用于人工催產(chǎn)親本選擇標(biāo)準(zhǔn)為體形正常、體質(zhì)較好，雌魚(yú)腹部膨大、柔軟，倒提腹部下塌，泄殖孔凸起的；雄魚(yú)選擇大小均勻，上頜部珠星明顯，輕壓腹部有乳白色精液，遇水即散的個(gè)體。

1.2 人工催產(chǎn)

催產(chǎn)藥物組合為地歐酮(domperidone,DOM)和促黃體素釋放激素類(lèi)似物(LHRH-A2)，采用1針注射，每千克雌魚(yú)注射10 mg DOM+10 μg LHRH-A2，每千克雄魚(yú)注射5 mg DOM+5 μg LHRH-A2，催產(chǎn)藥物溶劑為注射用葡萄糖。注射激素后，跟蹤觀察親魚(yú)反應(yīng)情況，每24 h檢查雌魚(yú)1次，一旦發(fā)現(xiàn)能順利擠出卵子，采用100 g/m3的MS-222進(jìn)行麻醉，稱(chēng)量體重、體長(zhǎng)后進(jìn)行干法人工授精。

催產(chǎn)率=(產(chǎn)卵的雌魚(yú)數(shù)/催產(chǎn)的雌魚(yú)數(shù))×100%。

效應(yīng)時(shí)間為注射催產(chǎn)劑到發(fā)情產(chǎn)卵排精的時(shí)間。

1.3 精子活力觀察

雄魚(yú)在催產(chǎn)前，催產(chǎn)1、2、3、4、5 d各隨機(jī)取5尾魚(yú)，將精液(直到擠不出)置于5 mL帶刻度離心管中，記錄精液體積，存放于4 ℃冰箱，每隔2 h觀察一次精子活力，直到絕大部分精子停止運(yùn)動(dòng)。雄魚(yú)催產(chǎn)精子活力的觀察和測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]方法并改進(jìn)運(yùn)用。可用于人工授精精子標(biāo)準(zhǔn)：整個(gè)視野中70% 精子呈“旋渦”狀運(yùn)動(dòng)，無(wú)法看清精子的運(yùn)動(dòng)路線，時(shí)間不少于40 s。精子有效保存時(shí)間為在4 ℃條件下，從精液擠出直到不能用于人工授精的時(shí)間。

1.4 人工授精

采取干法進(jìn)行人工授精。用于干法人工授精的精液先用離心管收集，遮光存放于冰盒中，在顯微鏡下鏡檢，使用活力好的精液。雌雄比為1 ∶1。

1.5 人工孵化

孵化容器為48 cm×35 cm×4 cm的自制孵化框，孵化框置于280 cm×50 cm×25 cm平列槽中，從一端進(jìn)入曝氣后的井水，水交換量為3次/h，平列槽中水流速0.01～0.02 m/s，溶氧≥8 mg/L，水溫11.5～12.0 ℃。將受精卵平鋪在孵化框內(nèi)，孵化密度5～7 粒/cm2，每天8:00、16:00、24:00攪動(dòng)魚(yú)卵1次，防止魚(yú)卵堆積，局部缺氧死亡。第3～4 d，魚(yú)卵發(fā)育到原腸中期-晚期，剔除死魚(yú)并統(tǒng)計(jì)魚(yú)卵受精率。

魚(yú)卵受精率=100%×原腸中期活卵數(shù)/魚(yú)卵總數(shù)

魚(yú)卵孵化率=100%×出膜魚(yú)苗數(shù)/受精卵總數(shù)

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2010進(jìn)行計(jì)算、統(tǒng)計(jì)與作圖，雄魚(yú)精液量及有效保存時(shí)間數(shù)據(jù)采用Spss 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA進(jìn)行單因子方差分析，若差異顯著，則采用Duncan′s進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 自然生產(chǎn)拉薩裂腹魚(yú)雌魚(yú)產(chǎn)卵量、受精率及孵化率

2019年4月1日、4月3日、4月5日、4月9日收集的4批拉薩裂腹魚(yú)親本自然產(chǎn)卵60組，共計(jì)產(chǎn)卵77.58萬(wàn)粒。親本體重(752.06～2 932.95)g，平均(1 643±395)g；體長(zhǎng)(45.1～60.5)cm，平均(51.64±3.08)cm；每組產(chǎn)卵量(3 012～30 208)粒，總產(chǎn)卵量77.58萬(wàn)粒；總計(jì)獲得受精卵66.02萬(wàn)粒，受精率(54.29～99.53)%，平均(85.10±11.13)%；總計(jì)出膜魚(yú)苗56.61萬(wàn)尾，孵化率(5.00～98.08)%。

2.2 人工催產(chǎn)雌性親本效應(yīng)時(shí)間、催產(chǎn)率、受精率及孵化率

親本效應(yīng)時(shí)間72～96 h，72 h占比90.67%，96 h占比9.33%。2019年4月3日催產(chǎn)拉薩裂腹魚(yú)親本68組，4月5日～4月6日累計(jì)繁殖63組，催產(chǎn)率92.65%；2019年4月7日，催產(chǎn)15組，4月9日累計(jì)繁殖12組，催產(chǎn)率80%。4月3日和4月7日繁殖兩批拉薩裂腹魚(yú)親本總計(jì)75組，平均催產(chǎn)率90.36%。兩批雌魚(yú)體重范圍(1 048.26～2 910.06)g，平均(1 574±375)g；體長(zhǎng)范圍(48.6～66.0)cm，平均(50.79±3.63)cm；產(chǎn)卵量(5 720～42 425)粒/尾；受精率(37.43～99.77)%，平均(79.07±16.14)%；孵化率(6.36～99.44)%，平均(87.86±24.80)%。

2.3 拉薩裂腹魚(yú)雌性親本體長(zhǎng)體重與產(chǎn)卵數(shù)量關(guān)系

拉薩裂腹魚(yú)雌性親本體長(zhǎng)體重與產(chǎn)卵數(shù)量關(guān)系見(jiàn)圖1～2。隨著拉薩裂腹魚(yú)雌性親本體長(zhǎng)體重增加，拉薩裂腹魚(yú)產(chǎn)卵量逐漸增加。

圖1 拉薩裂腹魚(yú)體重與產(chǎn)卵總數(shù)量關(guān)系

2.4 人工催產(chǎn)雄性親本精液數(shù)量及質(zhì)量

人工催產(chǎn)雄性親本精液數(shù)量及質(zhì)量見(jiàn)表1～2。隨著人工催產(chǎn)時(shí)間增加，拉薩裂腹魚(yú)雄魚(yú)精液量呈先升高后降低變化趨勢(shì)，且在第2 d精液量最多(8.58±5.28)mL，同1 d和3 d差異不顯著，顯著多于未催產(chǎn)和催產(chǎn)4 d、5 d雄性親本精液量。

表1 拉薩裂腹魚(yú)雄魚(yú)催產(chǎn)時(shí)間和精液量關(guān)系

在4 ℃條件下，拉薩裂腹魚(yú)精液有效保存時(shí)間在未催產(chǎn)和催產(chǎn)1 d差異不顯著；催產(chǎn)第2 d，有效保存時(shí)間顯著升高，且達(dá)到最大值(46.4±18.02)h；催產(chǎn)第3 d后，精液有效保存時(shí)間顯著降低。

圖2 拉薩裂腹魚(yú)體長(zhǎng)與產(chǎn)卵總數(shù)量關(guān)系

表2 拉薩裂腹魚(yú)雄魚(yú)催產(chǎn)時(shí)間和精液有效保存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

3.1 自然產(chǎn)卵和人工催產(chǎn)產(chǎn)卵量、魚(yú)卵受精率及孵化率比較

本實(shí)驗(yàn)中，自然產(chǎn)卵親本單位體重及體長(zhǎng)產(chǎn)卵量低于人工催產(chǎn)親本，受精率高于人工催產(chǎn)親本，孵化率低于人工催產(chǎn)親本。其原因可能是在野外自然成熟親本，運(yùn)輸過(guò)程中部分卵粒流出，導(dǎo)致其單位體重產(chǎn)卵量較人工催產(chǎn)低。受精率和孵化率受魚(yú)類(lèi)卵子質(zhì)量、精子質(zhì)量及操作方法的影響，在精子質(zhì)量和操作方法相同時(shí)，卵子質(zhì)量決定魚(yú)卵受精率和孵化率。在自然界，野生親本性腺能正常發(fā)育成熟；人為捕撈后，受環(huán)境的影響，親本性腺很難繼續(xù)發(fā)育，性腺發(fā)育接近V期的親本可以通過(guò)注射性激素刺激，達(dá)到性成熟；因此，理論上自然成熟親本魚(yú)卵質(zhì)量較人工催產(chǎn)親本好。但張良松對(duì)野生異齒裂腹魚(yú)[17]的研究發(fā)現(xiàn)，自然成熟親本由于部分性腺已發(fā)生退化過(guò)熟，其受精率、孵化率低于人工催產(chǎn)的親本。由于自然界親本成熟時(shí)間不明確，且不同親本成熟時(shí)間不同步，能獲得自然成熟親本數(shù)量較少，因此，在拉薩裂腹魚(yú)規(guī)模化人工繁殖過(guò)程中一般選擇性腺接近成熟的親本進(jìn)行人工催產(chǎn)。

3.2 拉薩裂腹魚(yú)催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間影響因素

魚(yú)類(lèi)人工催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間受魚(yú)的種類(lèi)、催產(chǎn)藥物種類(lèi)、劑量及環(huán)境水溫等因素的影響。適宜種類(lèi)的催產(chǎn)藥物及劑量可獲得較好的催產(chǎn)率并適當(dāng)縮短催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間。本試驗(yàn)中拉薩裂腹魚(yú)催產(chǎn)藥物種類(lèi)及劑量較細(xì)鱗裂腹魚(yú)[18]、重口裂腹魚(yú)[19]、齊口裂腹魚(yú)[20]、異齒裂腹魚(yú)[17]、拉薩裸裂尻魚(yú)[21]均差別較大，催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間也長(zhǎng)于以上魚(yú)類(lèi)(表3)，這可能是與魚(yú)種類(lèi)、催產(chǎn)藥物種類(lèi)及計(jì)量、養(yǎng)殖水溫有關(guān)。水溫是影響魚(yú)類(lèi)催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間的主要因素，一般水溫越高，效應(yīng)時(shí)間越短。魚(yú)類(lèi)適宜催產(chǎn)水溫根據(jù)魚(yú)類(lèi)生存水域環(huán)境水溫不同而不同，細(xì)鱗裂腹魚(yú)在水溫低于13 ℃時(shí)無(wú)法產(chǎn)卵，高于18 ℃時(shí)性腺則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重退化[18]。試驗(yàn)中拉薩裂腹魚(yú)長(zhǎng)期生活在高原水域環(huán)境中，水溫較低，因此拉薩裂腹魚(yú)催產(chǎn)水溫較低，催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。關(guān)于縮短拉薩裂腹魚(yú)人工催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間有待進(jìn)一步研究。

表3 拉薩裂腹魚(yú)與其他裂腹魚(yú)魚(yú)類(lèi)催產(chǎn)劑量、效應(yīng)時(shí)間與水溫比較