飼料中添加還原型谷胱甘肽對中華鱉生長性能、血清生化指標及肝臟超氧化物歧化酶基因表達的影響

陸 星，吳 凡，文 華，劉 偉，田 娟，蔣 明，喻麗娟，梁宏偉

(中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

中華鱉(Pelodiscussinensis)，俗稱甲魚，隸屬脊椎動物亞門爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬，是我國重要的特種水產養殖品種之一[1]。據2019年中國漁業年鑒報道，全國鱉的養殖產量達到31萬t以上。目前，中華鱉的養殖已逐漸從小規模的土池養殖進入到集約的溫室養殖[2]。但集約化養殖過程中會出現大量的應激因子，如擁擠、環境惡化(包括溫度、氨氮、溶氧、亞硝酸鹽)等導致機體代謝異常，引起氧化應激和免疫功能下降，從而造成其氧化損傷、生長速度降低甚至引發病害。因此，運用營養調控手段，在飼料中添加抗氧化物質提高中華鱉的生長性能和抗氧化應激能力，將對中華鱉的健康養殖產生積極作用。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸與甘氨酸結合而成的三肽活性物質。作為真核細胞中重要的生物活性物質，GSH在清除機體內的自由基時起關鍵作用[3]。對畜禽的研究表明，飼料中添加適量的GSH可提高仔豬[4]和肉雞[5]的生長性能和抗氧化能力。在水產養殖上，對GSH的研究主要集中于淡水和海水養殖魚類。例如，趙紅霞等[6]報道，飼料中添加GSH可以提高草魚(Ctenopharyngodonidellus)血清中胰島素生長因子IGF-1的水平，并增強其非特異性免疫功能。羅非魚(Oreochromisniloticus)飼料中添加一定量的GSH能夠顯著提高其總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力[7]。王芳倩等[8]研究發現，飼料中添加適量的GSH能夠增強牙鲆(Paralichthysolivaceus)的生長和抗氧化能力。然而，關于GSH應用在爬行類的研究報道還較少。因此，本實驗以中華鱉為研究對象，探討飼料中添加GSH對中華鱉生長性能、血清生化指標及肝臟超氧化物歧化酶基因表達的影響，以便為GSH在中華鱉飼料中的合理應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以白魚粉、啤酒酵母和大豆濃縮蛋白為蛋白源，豆油為脂肪源的基礎飼料，在其中分別添加0、100、200和400 mg/kg的GSH，并依次設置為G0(對照)、G100、G200和G400共4個試驗組。還原型GSH購自西安皓源生物技術有限公司，飼料中GSH的實測值分別為：0、96.57、184.11和367.93 mg/kg。各組飼料配方及營養成分見表1。

表1 各組飼料配方及其基本營養組成(干重)

1.2 試驗魚和飼養管理

養殖試驗在安徽喜佳農業發展有限公司中華鱉養殖場的溫室進行。試驗前將雄性日本品系中華鱉馴養2周。結束后，選擇大小均勻、健康無病的雄性日本品系中華鱉(均重389.18 g±5.98 g)36只。試驗鱉隨機分成4組，每組9只(3個平行，每個平行3只)，飼養于12個長方形塑料箱(90 cm×60 cm×35 cm)中，箱中水深約25 cm，每個養殖箱中掛3塊網片，供中華鱉攀爬棲息，箱中設置一塊20 cm×30 cm的食臺，食臺設在水下2～3 cm。每天投喂6～8 mm左右的顆粒飼料，分三次投喂(8:30、13:30和18:30)，并留樣用于基礎飼料營養成分分析。投喂量按其體重的1%，以20 min之內吃完為宜。若觀察到有未食完餌料,收集烘干稱重并記錄。每晚20:00用吸管清除養殖箱中糞便，并補充新水，每3 d換水一次。養殖實驗持續8周，飼養期間水溫控制在(32±1)℃。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 樣品采集

養殖試驗結束后，禁食24 h，稱重并計算其增重率、飼料效率和肝體比。將中華鱉從頸動脈處取血，制備血清；分離其背甲與腹甲，解剖取出肝臟并稱重，用于計算肝體比，另取約0.2 g左右的肝組織放入液氮冷凍保存，用于基因表達分析。取四肢肌肉樣品，并儲存于-20 ℃冰柜，用于常規營養成分的測定。

1.3.2 生長指標計算

增重率(WGR)=100%×(Wt-W0)/W0

飼料效率(FE)=增重量/投飼量

肝體比(HSI)=100%×(肝臟重/體質量)

式中：Wt為試驗結束時鱉的體質量；W0為初始體質量

1.3.3 常規營養成分測定

水分含量檢測采用直接干燥法(GB/T 5009.3-2003)；粗蛋白含量檢測采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)；粗脂肪含量檢測采用索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)；灰分含量測定采用灼燒稱重法(GB/T 5009.4-2003)(中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會，食品衛生檢測方法理化部分)。

1.3.4 血清生化指標檢測

血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)含量、谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性采用日本希森美康全自動生化分析儀(Sysmex,CHEMIX-800)測定，所用試劑均購自Sysmex公司。

1.4 RNA提取、反轉錄和熒光定量 PCR(qPCR)

采用TRIZOL方法(Invitrogen，美國)提取各組中華鱉肝臟組織的總RNA，并用RNase-free DNase I(Takara)去除殘余的DNA，取1 μL RNA樣品快速高壓電泳以檢測RNA完整性，用紫外分光光度計(Biophotometer Eppendorf)對RNA濃度進行測定，按照Fermentas RevertAidTM First試劑盒的操作說明書進行cDNA第一鏈的合成。

使用Applied Biosystems 7500實時定量PCR檢測系統進行qPCR分析，熒光定量試劑SYBR Green Real Master Mix購自天根生化科技有限公司。根據GenBank序列設計超氧化物歧化酶1(sod1)和超氧化物歧化酶2(sod2)基因的引物(采用Primer Premier 6.0軟件設計)，同時選用中華鱉β-actin基因作為內參，引物序列見表2。PCR反應體系：2×SYBR Green Real Master Mix 10 μL，10 μmol/L的正、反向引物各0.4 μL，10倍稀釋的第一鏈cDNA樣品5 μL，超純水補足至20 μL。PCR反應條件：95 ℃，5 min；(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s)，40個循環；然后每個循環增加1 ℃，從65 ℃升高到95 ℃進行溶解曲線分析，各組反應都重復3次。采用2-△△Ct方法計算各基因表達的變化倍數[9]。

表2 熒光定量PCR所用的引物序列

1.5 統計分析

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0統計軟件中one-way ANOVA方差分析和Duncan氏均值多重比較對試驗數據進行分析，P<0.05時認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 飼料中添加GSH對中華鱉生長性能的影響

養殖試驗結束后，各組的中華鱉存活率均為100%。由表3可知，添加GSH各組中華鱉的WGR和FE均高于G0組，且在G200組達到最大值(P<0.05)。而各組的HSI無顯著性差異(P>0.05)。

表3 飼料GSH水平對中華鱉生長性能和飼料利用的影響

2.2 飼料中添加GSH對中華鱉肌肉營養成分的影響

由表4可知，GSH添加組的粗蛋白和粗脂肪含量均高于G0組，其中G200和G400組的粗蛋白含量顯著高于G0組，G200組的粗脂肪含量顯著高于G0組。而飼料GSH水平對中華鱉肌肉水分和灰分含量無顯著影響。

表4 飼料GSH水平對中華鱉肌肉營養成分的影響

2.3 飼料中添加GSH對中華鱉血清生化指標的影響

由表5可知，飼料中添加谷胱甘肽對中華鱉TCHO、TG、GLU、TP和ALT活性均無顯著影響。而與G0組相比，G400組血清AST的活性則顯著上升。

表5 飼料GSH水平對中華鱉血清生化指標的影響

2.4 飼料中添加GSH對中華鱉肝臟超氧化物歧化酶基因表達的影響

如圖1所示，GSH添加組的肝臟sod1基因相對表達量均高于G0組，其中G200組的相對表達量最高，顯著高于G0組；sod2基因相對表達量隨著GSH添加量的增加呈不斷升高的趨勢，在G400組出現最高值，相比G0組上升1.32倍。

圖1 GSH對中華鱉肝臟sod1和sod2基因表達量的影響

3 討論

3.1 GSH對中華鱉生長性能的影響

本研究中添加適量的GSH能顯著提高中華鱉的WGR和FE，表明GSH可以改善中華鱉的生長性能。該結果與GSH在牙鲆[8]、草魚[10]、羅非魚[11]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[12]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[13]、鱸(Dicentrarchuslabrax)[14]及凡納濱對蝦(Litopenaeusvanname)[15]等水產動物中的研究結果相似。另外，部分研究報道了飼料中添加GSH對花鱸(Lateolabraxjaponicus)[16]、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[17]和斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[18]的生長無顯著影響，分析可能與GSH在不同動物的作用途徑有關。

本實驗結果顯示，G200組和G400組肌肉粗蛋白、G200組肌肉粗脂肪含量顯著高于G0組。這說明飼料中添加一定量的GSH可顯著影響中華鱉的粗蛋白和粗脂肪含量。這一結果與其在草魚[10]、羅非魚[11]和黃顙魚[12]上的結果相似，但在花鱸[16]和奧尼羅非魚[19]上沒有顯著性差異。這可能與GSH對不同魚種蛋白質和脂肪代謝的作用方式不同有關。

3.2 GSH對中華鱉血清生化指標的影響

血清膽固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)是重要的脂類物質,它們含量的高低在一定程度上反映了機體內的脂類吸收和肝臟脂肪代謝狀況[19]。在本實驗中，添加GSH的各組血清TCHO和TG均高于G0組，這與在草魚[10]、羅非魚[11]和黃顙魚[12]上的研究結果一致。其原因可能是GSH 促進了中華鱉體內生長激素GH的分泌，從而增強了其脂肪代謝，導致血清TCHO和TG含量的升高。血糖(GLU)來源于肝糖原分解和腸道吸收，是機體主要的供能物質。血清總蛋白(TP)含量可反映機體蛋白質代謝和營養狀態，同時也與免疫相關聯。研究表明，血清TP的含量主要受飼料蛋白源質量的影響，進而顯著影響機體的蛋白質代謝[20]。本實驗中，添加GSH的各組GLU和TP含量與G0組無顯著差異，這與在草魚[10]、羅非魚[11]和黃顙魚[12]上的研究結果相同。其原因可能與各組飼料原料和營養水平一致有關。

谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)主要存在于肝細胞內，是機體內轉氨基作用過程中非常重要的酶，臨床上常以血清中轉氨酶活性來衡量肝臟是否受損[21]。本實驗中，添加GSH的各組血清AST活性均高于G0組，且在G400組達到顯著水平(P<0.05)。而飼料中添加GSH對ALT的活性無顯著影響，但G200和G400組的活性高于G0組。這些結果表明高劑量的GSH可能會影響對中華鱉肝臟的正常生理功能，但同時有助于轉氨基作用，進而增強機體合成非必需氨基酸的能力。

3.3 GSH對中華鱉肝臟超氧化物歧化酶基因表達的影響

超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于動植物中，根據分布的不同主要分為SOD1(Cu/Zn SOD，主要分布于胞漿)和SOD2(Mn/Fe SOD，主要分布于線粒體)。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧化物發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而降低或清除細胞內氧自由基含量。因此，其活性的高低可在一定程度上反映機體內氧自由基的代謝情況及抗氧化能力[22-23]。在正常情況下，sod基因的啟動子處于未開放狀態，當機體受到刺激或逆境脅迫時，相關轉錄因子可與sod基因啟動子的順式作用元件結合，激活sod基因發生轉錄，進而表現在翻譯水平上，使SOD的活性上升[24]。周婷婷等[25]研究表明，飼料中添加一定量的GSH能提高吉富羅非魚sodmRNA的表達量。對凡納濱對蝦的研究也有相似結果，劉曉華等[26]表明飼料中添加適量的GSH可誘導其肝胰腺細胞sod基因的轉錄表達，進而使肝胰腺細胞的SOD活性上升。本研究的結果顯示，GSH添加組的中華鱉肝臟sodmRNA表達量均高于G0組，其中G200組sod1 mRNA的表達量最高，而G400組sod2的表達量最高。這些結果表明，具有抗氧化功能的GSH可誘導中華鱉肝臟sod基因的表達，從而抑制活性氧自由基介導的脂質過氧化反應[27]。

綜上所述，飼料中添加一定量的GSH能改善中華鱉的生長性能，提高肌肉粗蛋白和粗脂肪含量以及部分血清生化指標活性。此外，GSH還可誘導中華鱉肝臟sod1和sod2基因的轉錄表達，從而提高機體的抗氧化能力。