4種鯉科魚類精子特性及不同pH對其活力的影響

王 雨，楊 建，耿龍武，張宇婷，姜海峰，徐 偉

(1.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

魚類的精子活力主要是指精子壽命和精子運動狀態等[1]，主要以精子激活比例和精子運動時間等作為主要評價指標[2]，精子活力的大小直接制約著精子的受精能力[3]。研究表明，水體中pH、無機離子、溫度、有機溶劑等因素對精子活力影響顯著[4]。我國東北地區鹽堿水域因其高堿度、高pH值等水質特點[5]，對魚類的生長、繁殖影響較大，導致品種單一，漁業生產處于較低的水平。因此，開展pH對淡水魚類精子活力相關研究，對篩選適應不同鹽堿水體環境的增養殖魚類品種具有重要意義。

擬赤梢魚(Pseudaspiusleptocephalus)、洛氏鱥(PhoxinuslagowskiiDybowskii)、松浦鏡鯉(CyprinuscarpioSongpu)和方正鯽(C.auratus)均屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)魚類，其中，洛氏鱥、松浦鏡鯉、方正鯽因其環境適應能力強[6-9]，是目前黑龍江水產研究所在鹽堿水域示范推廣的重點魚類品種。本研究通過顯微觀察法，研究了pH對擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉和方正鯽精子活力的影響，旨在闡明4種魚類精子的酸堿耐受性，完善不同pH環境魚類的繁殖生物學特性，為東北鹽堿地區的漁業生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗魚取自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所呼蘭試驗站，選擇成熟度好、健康無傷、體型正常擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉和方正鯽各6尾，隨機選擇3尾魚精液用于精子活力和精液理化性質檢測，4種魚類樣品質量參數見表1。

表1 4種鯉科魚類樣品質量參數

1.2 不同梯度試劑的配制

根據鄭學斌等[10]、李常鍵等[11]對鯉科魚類精子活力的研究，用0.1 mol/L的鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液與去離子水分別配制5種pH為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的梯度溶液。實驗所用的氫氧化鈉、鹽酸均為國產分析純。

1.3 精液采集

將選取好的雄魚進行人工藥物催產，待效應時間后，用干燥潔凈的毛巾擦去魚體表面及生殖孔附近的水分，輕壓魚腹部使精液流出，滴入2 mL離心管中，4 ℃暫存待測。精液采集過程中摻入尿液、血液和糞便的樣本不予使用。

1.4 精液理化特性測定

1.4.1 精液濃度

精液由精子和精漿組成，精子細胞體積占精液總體積的百分比，即精液濃度[12]。計算公式：

精液濃度=(精液總體積-上清液體積)/精液總體積×100%

本實驗將采集的精液取1 mL，常溫1 000 r/min離心30 min，每種魚類測定3個樣本，并計算其平均值。

1.4.2 精子密度

本實驗取采集的精液2 μL，用0.85%的NaCl溶液，將精液稀釋1 000倍，用血球計數板在顯微鏡下計數，計算精子密度，每種魚類測定3個樣本，結果取平均值。

精子密度(個/mL)=(80小格內精子數/80)×400×104×稀釋倍數[13]

1.4.3 精漿pH檢測

取新鮮采集精液2 mL，用pH儀(Sartorius)測定精液的pH。

1.5 精子活力觀察與測定

用解剖針蘸取微量精液于載玻片上，100 μL移液槍吸取不同pH精子激活液滴加3滴至精液，并迅速用槍頭將其攪勻，無需加蓋蓋玻片，同時用秒表計時，于10×10倍光學顯微鏡(BX1 Olympus microscope)下觀察，并記錄精子激活率、快速運動時間、運動時間及精子壽命。精子活力觀察標準參照蘇德學等[14]的等級標準：精子的激活率以激活起始時給定視野內被激活精子數量占全部精子數量的百分數計算；精子快速運動時間(FT)以精子激活開始至70%的精子能看清運動軌跡的時間計算；精子的運動時間(MT)以精子激活開始至90%的精子原地顫動為止的時間計算；精子的壽命(LT)以精子自然激活開始至90%的精子停止運動為止的時間計算。每個pH梯度每種魚類檢測3個樣本，取其平均值。

1.6 數據分析

使用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用Duncan法進行多重比較以檢驗其差異顯著性(P<0.05)，使用GraphPad Prism 5.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 精液基本理化特征

擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉、方正鯽新鮮精液的精液濃度和精子密度如表2所示，精液濃度由高到低依次為松浦鏡鯉>方正鯽>洛氏鱥>擬赤梢魚，精子密度由高到低依次為松浦鏡鯉>洛氏鱥>方正鯽>擬赤梢魚；洛氏鱥精漿偏酸性，擬赤梢魚精漿呈中性，而松浦鏡鯉、方正鯽精漿呈弱堿性。

表2 4種鯉科魚類精液基本理化特征

2.2 pH對精子活力的影響

pH對精子活力的影響如圖1所示，4種鯉科魚類的精子在pH 3.0～11.0范圍內，其活力均隨著pH的升高而呈現先升高后降低的變化趨勢；其中，擬赤梢魚、洛氏鱥精子的激活率、FT、MT、LT均在pH 7.0時達到最高，精子激活率分別為(93.99±5.77)%和(96.67±2.89)%，FT分別為(35.32±0.81)s和(34.27±0.49)s，MT分別為(52.24±0.99)s和(44.33±0.76)s，LT分別為(71.50±5.50)s和(75.22±3.50)s；松浦鏡鯉精子激活率在pH 7.0時最高，為(96.67±2.89)%，其FT、MT和LT在pH為9.0時達到最大值，分別為(46.80±1.82)s、(64.94±4.52)s和(84.03±7.02)s；方正鯽精子活力的4個指標均在pH 9.0時達到最高，分別為(93.33±2.89)%、(35.37±0.31)s、(85.18±2.04)s和(100.74±1.65)s。

圖1 不同pH條件下4種鯉科魚類精子活力變化

3 討論

3.1 精液的基本生物學特征

精子密度和精液濃度是評價魚類精子生物學特性的主要指標。一般而言，同種魚類精子密度越高，精液濃度越大，而不同魚類之間魚類的精子密度和精液濃度因種類不同、精子形態、體積或繁殖季節不同而有各異[15]。

研究發現，不同魚類精子密度差異較大，如鱘科魚類精子密度相對較低，波斯鱘(Acipenserpersicus)[16]精子平均密度為1.54×109個/mL，中華鱘(A.sinensisGray)[17]精子平均密度為3.26×109個/mL；而鯉科魚類精子密度則較高，四大家魚精子平均密度為2.66×1010個/mL[18]。本研究中的4種鯉科魚類，其精子密度均與四大家魚的研究結果相近，其數量級均為1010個/mL。

本研究中，4種鯉科魚類的精子密度和精漿濃度在種間整體表現為精子密度越大，精液濃度越高的趨勢，松浦鏡鯉精液濃度與精子密度在4種鯉科魚類中最高，而擬赤梢魚精液濃度與精子密度則最低。Noveiri等[16]的研究同樣表明，精液濃度和精子密度之間存在著顯著正相關性，而魯大椿等[18]對部分淡水魚類精液生物學研究中亦有相似發現。此外，在本研究中方正鯽、洛氏鱥精液濃度與精子密度大小順序相反，推測出現這一現象是因為洛氏鱥精子個體較小，導致精子在精漿中的總體積減小。

在本研究中，擬赤梢魚精漿呈中性，松浦鏡鯉、方正鯽精漿呈弱堿性，而洛氏鱥精漿偏酸性，種間差異較大，但大多數魚類的精漿pH偏堿性[19]，只有少部分魚類精漿呈弱酸性，如大黃魚(Pseudosiaenacrocea)[20]精漿pH為6.7～7.2，目前有關魚類精漿偏酸性的原因尚不清楚，有學者推測這是與環境相適應的結果[21]。

3.2 pH對精子活力的影響

外界pH環境是影響魚類精子活力的重要因素之一，當精子處于適宜的pH環境條件下才可被有效激活。研究發現，無論是淡水魚類[22,23]，還是海水魚類[24,25]，其精子活力在中性或弱堿性的環境下精子激活率最高，且活性最強，而在酸性條件下魚類精子激活率降低、壽命短。

本研究證明，擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉和方正鯽4種鯉科魚類精子活力在pH 7.0～9.0時效果較好，而在強酸、強堿脅迫下表現差異較大。在pH 3.0(H+濃度為10-3mol/L)強酸性條件下，擬赤梢魚精子完全失活，洛氏鱥的精子激活率僅為21%，方正鯽和松浦鏡鯉精子僅能原地顫動；而在pH 11.0(OH-濃度為10-3mol/L)強堿條件下，擬赤梢魚部分精子仍具有活力，方正鯽精子激活率仍可達75%，松浦鏡鯉、洛氏鱥精子活力雖然受到抑制，但其激活率仍高于45%。對比強酸與強堿性環境對魚類精子活力的影響發現，強酸條件對精子活力的抑制作用明顯高于強堿環境，這一現象，在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[26]中也得到了證實。根據Morisawa等[27]的假說，這可能是由于胞外H+濃度的增加會破壞精子細胞結構，進而抑制精子活力和降低受精率所致。

綜上所述，擬赤梢魚精子對水體pH的變化環境最為敏感，而松浦鏡鯉、洛氏鱥次之，方正鯽精子對pH適應性較強。在開展魚類人工繁育過程中，為提高其受精率，擬赤梢魚使用的水源pH應控制在7.0中性相對穩定的環境，而松浦鏡鯉、洛氏鱥、方正鯽pH控制在7.0～9.0弱堿性環境即可。