BMP2和BMP4對牙釉質基質蛋白酶表達的調控

劉向暉，耿碩碩，吳 迪，李 瑩，羅曉娜，許瑩瑩，袁浩澤，王秀梅，謝曉華

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一類調節(jié)多種發(fā)育過程的生長因子，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中最大的亞群[1]。BMPs最初是1965年被發(fā)現(xiàn)并從脫鈣骨基質中分離出的，它能夠誘導異位骨的形成。隨著研究的深入，目前已知BMPs會影響許多生物系統(tǒng)的形成和功能，包括鐵代謝、癌癥、骨和肌肉的發(fā)育等[2-4]。牙齒發(fā)育過程中的細胞分化是由牙齒上皮細胞和間充質細胞之間相互作用所產生的[5]，而BMPs在牙齒發(fā)育過程中可以調節(jié)上皮-間質的相互作用，并在早期礦化過程中發(fā)揮作用[6]。在這個過程中，BMP2在上皮細胞和間質細胞中均有表達[7]。牙齒中的BMP2能夠誘導成釉細胞的分化和調節(jié)釉質相關基因的表達，并能夠在早期牙礦化過程中協(xié)調成牙本質細胞和成釉細胞的分化[8]。在早期牙齒發(fā)育過程中，BMP4的表達從牙上皮細胞向間充質細胞轉移，BMP4在牙形態(tài)發(fā)生的上皮-間質相互作用中起主要作用[9-10]。BMP4還可以在體外培養(yǎng)的條件下激活成釉細胞和成牙本質細胞[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)使用Osx-Cre條件性敲除BMP2可以導致小鼠出現(xiàn)釉質發(fā)育異常，使用Wnt1-Cre條件性敲除BMP4可以導致小鼠的牙齒出現(xiàn)不同程度的損害[12-13]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)BMP2和BMP4上皮條件性基因敲除鼠會表現(xiàn)出釉質生成不良(amelogenesis imperfecta，AI)的癥狀，同時基因敲除鼠成釉上皮也表現(xiàn)出MMP20和KLK4基因轉錄水平的下降[14]。本實驗研究了體外情況下BMP2和BMP4對牙釉質基質蛋白酶表達的影響，以期進一步闡明BMP2和BMP4蛋白對牙釉質發(fā)育的作用機制。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑

7500型實時熒光定量PCR儀(Thermo，美國)；Western blot顯影儀(天能，中國)；低溫高速離心機(Thermo，美國)；電子顯微鏡(Nikon，日本)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；FBS(Gibco，美國)；青霉素(Sigma，美國)；鏈霉素(Sigma，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；重組小鼠BMP2蛋白(R&D，美國)；重組小鼠BMP4蛋白(R&D，美國)；Dorsomorphin(Sigma，美國)；逆轉錄試劑盒(Takara，日本)；SYBR熒光定量聚核酶鏈反應試劑盒(TaKaRa,日本)；MMP20、KLK4、GAPDH引物(Invitrogen，美國)；組織總蛋白提取試劑盒(Sigma，美國)；蛋白BCA定量試劑盒(碧云天，中國)；本實驗所用一抗：MMP20(abcam，美國)；KLK4(abcam，美國)；GAPDH(CST，美國)；P-Smad1/5/8(CST，美國)；pan-Smad1/5/8(abcam，美國)；P-p38(CST，美國)；pan-p38(CST，美國)；二抗(索萊寶，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞及培養(yǎng)條件 小鼠成釉細胞系ALC由濱州醫(yī)學院所贈，細胞系采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫孵箱中進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后，每3 d換液一次,待細胞生長至80%匯合時常規(guī)傳代培養(yǎng)或給藥處理。重組小鼠BMP2蛋白和BMP4蛋白的使用濃度為100 ng/mL，BMP通路抑制劑Dorsomorphin溶于DMSO，使用濃度為20 μmol/L。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測采用RT-PCR技術。ALC細胞經(jīng)處理后使用Trizol法提取RNA。通過逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉成cDNA。定量PCR反應總體積為20 μL，具體組成如下：逆轉錄cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×TB Green Premix(Takara)10 μL，無酶水7 μL。PCR引物序列如下，KLK4：5′-AACCTAAGGGACAGGGCAGT-3′,5′-GACAGTATCGGCCTCAGGAA-3′；MMP20：5′TGTCTAAGCTCAAGGTGCCCTGTT-3′,5′-TAAGTTGTCCATGTGGGTGCTGGA-3′；GAPDH：5′-TCCAGAACATC-ATCCCTGCCTCTA-3′,5′-ACAAAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。擴增流程如下：94 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品重復3次，結果采用2-ΔΔCT方法進行比較。

1.2.3 Western blot檢測蛋白 根據(jù)組織總蛋白提取試劑盒操作說明提取細胞系樣品組織蛋白，使用蛋白BCA定量試劑盒測定樣品蛋白濃度，向樣品中加入還原性loading buffer煮沸變性，配制10% SDS-PAGE凝膠，每孔上30 μg樣品，跑膠后電轉至PVDF膜上，采用5%脫脂奶封閉1 h，之后放入抗體中進行孵育，PBST洗滌后加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)中孵育，洗滌后進行曝光。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism8.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”形式報告，組間比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BMP信號通路的變化

Western blot結果顯示，與未加入蛋白刺激的對照組相比，BMP蛋白作用30 min后，Smad1/5/8及p38磷酸化水平明顯增加(圖1A)，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖1B)。這表明BMP2和BMP4蛋白聯(lián)合干預可以明顯激活BMP通路的活性，包括Smad依賴性通路(經(jīng)典通路)和Smad非依賴性通路(非經(jīng)典通路)。另一組樣本中加入BMP通路抑制劑(Dorsomorphin)，對照組加入等量的DMSO，處理3 h后取材。Western blot結果顯示和對照組相比Smad1/5/8的磷酸化水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖2)，而p38磷酸化的變化不明顯。該結果表明在BMP抑制劑的作用下，Smad依賴性通路(Smad1/5/8通路)的表達被抑制，而Smad非依賴性通路(p38通路)則不受影響。

與對照組比較，***P<0.001(n=3)

與對照組比較，***P<0.001(n=3)

2.2 牙釉質基質蛋白酶MMP20和KLK4的變化

Real-time PCR的結果顯示，與對照組相比，BMP蛋白刺激12 h后，MMP20和KLK4的基因表達明顯升高(P<0.01，圖3)；與對照組相比，抑制劑處理12 h后，Real-time PCR的結果顯示MMP20和KLK4的基因表達明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)。該結果表明BMP2和BMP4重組蛋白能夠正向調控MMP20、KLK4基因的表達，抑制劑Dorsomorphin可以負向調控MMP20、KLK4基因的表達，據(jù)此我們可以認為：BMP通路，尤其是Smad依賴性通路對MMP20、KLK4基因的表達具有至關重要的作用。

與對照組相比，**P<0.01,***P<0.001(n=3)

2.3 BMP蛋白的挽救作用

Western blot結果顯示，與未作處理的對照組相比，Dorsomorphin作用12 h后，MMP20和KLK4的蛋白表達明顯下降(P<0.001，圖4)。而BMP蛋白刺激12 h后，MMP20和KLK4的蛋白表達變化不大(圖4B)。同時存在Dorsomorphin和BMP蛋白的挽救組相較于抑制劑Dorsomorphin組，MMP20和KLK4的蛋白表達水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖4B)。該結果顯示BMP抑制劑Dorsomorphin抑制了MMP20和KLK4蛋白水平的表達；BMP2、BMP4蛋白對MMP20和KLK4蛋白水平表達的影響不大；在BMP抑制劑存在的情況下，再加入BMP2、BMP4蛋白進行刺激的結果顯示MMP20和KLK4的蛋白表達水平有了明顯的改善。BMP蛋白可以上調由于抑制劑Dorsomorphin導致的MMP20和KLK4蛋白水平的下降。

3 討 論

AI是鈣化障礙和釉質形成缺陷的一組遺傳性疾病，嚴重影響了牙齒的美觀和人們的生活質量。AI可以分為礦化不全型和形成不全型，但所有的類型都存在鈣化和釉質基質形成的障礙。成熟的牙釉質主要由無機物和極少量的有機成分和水組成。無機物為高度礦化、有序排列的羥基磷灰石晶體。有機成分主要是成釉細胞分泌的基質蛋白和蛋白酶，釉質基質蛋白包括釉原蛋白(amelogenin，AMEL)，成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)，釉蛋白(enamelin，ENAM)，釉成熟蛋白(amelotin，AMTN)和牙成釉細胞相關蛋白(odontogenic ameloblast-associated protein，ODAM)等；釉基質蛋白酶主要有MMP20和KLK4。在釉質基質蛋白相關基因中AMEL、AMBN和ENAM基因突變或缺失會引起人和小鼠牙釉質生成不良[15-17]。同時釉質基質蛋白酶中MMP20和KLK4基因的缺失也會導致釉質發(fā)育異常[18-21]。

與對照組相比，*P<0.05,***P<0.001；與抑制劑組相比，#P<0.001(n=3)

胞外配體BMP2和BMP4可以與BMPRⅡ形成二聚體，使得BMPRⅡ受體磷酸化。Ⅱ型受體能夠激活Ⅰ型受體，進一步磷酸化Smad1/5/8，然后磷酸化的Smad1/5/8在細胞核內與Smad4結合形成異質二聚體復合物。這種Smad復合物可以直接或者在其他DNA結合蛋白的參與下調控相關靶基因的轉錄[22]。BMP主要通過依賴Smad途徑和p38-MAPK途徑兩條信號通路發(fā)揮作用，且信號轉導過程受細胞外拮抗劑、膜受體、細胞質微環(huán)境和轉錄水平4個層次的調節(jié)控制。據(jù)研究顯示，條件性敲除Smad4小鼠也會表現(xiàn)出釉質和牙本質的發(fā)育不良，可以預見BMP-SMAD途徑對釉質發(fā)育至關重要[23]。

本課題組實驗結果顯示，BMP2、BMP4蛋白促進了ALC細胞Smad1/5/8和p38磷酸化蛋白的表達，而在加入BMP抑制劑Dorsomorphin后，Smad1/5/8磷酸化蛋白減少，p38磷酸化蛋白變化不大，說明Dorsomorphin阻斷了Smad1/5/8蛋白的磷酸化。現(xiàn)有研究顯示Dorsomorphin可以抑制ALK2、ALK3和ALK6-BMP Ⅰ型受體，而這些受體又可阻斷BMP介導的Smad1/5/8磷酸化和成骨分化[24]。同時課題組證明了使用一定濃度的BMP2、BMP4蛋白可以部分恢復Dorsomorphin阻斷的MMP20和KLK4蛋白的表達。綜上可見，BMP2和BMP4蛋白能夠通過影響B(tài)MP通路介導下游靶基因MMP20和KLK4的表達，而Smad依賴性通路在此調節(jié)中起主導作用，而Smad非依賴性通路對釉質發(fā)育的影響還需進一步探究。

AI作為一種干擾牙釉質形成或礦化的遺傳性疾病，臨床上尚缺乏有效且特異的干預治療手段，目前主要采用修復治療來改善外觀和功能，而最近的臨床研究表明BMP2和BMP4基因缺失可以導致病人出現(xiàn)牙齒發(fā)育不良的臨床癥狀[25]。這揭示了BMP2和BMP4可能是釉質生成不良疾病的潛在致病基因，對其進行的靶向預防和治療，可能為我們防治此類疾病提供新的想法和思路。