兩種滅菌方法對離體牙滅菌效果及粘接強度影響的研究

史 璐，李 豪，郭 笑，王 鵬，馬佳琳

離體牙被廣泛應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)的實驗教學(xué)和科學(xué)研究中，尤其是在牙本質(zhì)粘接劑粘接性能的研究中[1-2]。2003年美國疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)發(fā)布的《牙科醫(yī)療機構(gòu)感染控制指南》中明確規(guī)定：離體牙必須經(jīng)消毒滅菌處理后方可用于口腔醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)和科學(xué)研究[3-4]；推薦使用高壓蒸汽滅菌121 ℃，40 min對離體牙進行滅菌，對有銀汞合金充填物的離體牙推薦使用4%甲醛浸泡兩周。但甲醛是原漿毒物質(zhì)且具有致癌、致畸、致突變的生物學(xué)作用，不宜用于教研用離體牙的滅菌。盡管多種消毒滅菌方法被嘗試用于離體牙的消毒滅菌處理，但由于牙齒結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，目前尚缺乏一種既能夠達到滅菌效果，又能夠最小限度影響牙體硬組織結(jié)構(gòu)的滅菌方法[2,5-6]。

低溫等離子體滅菌是新一代滅菌技術(shù)。其基本原理是工作氣體在外加直流或交流電場的作用下電離產(chǎn)生低溫等離子體[7]。目前，有關(guān)低溫等離子體滅菌技術(shù)用于離體牙滅菌處理的研究尚罕見報道。本研究擬采用過氧化氫低溫等離子體滅菌技術(shù)處理離體牙，檢測其滅菌效果和對牙本質(zhì)粘接強度的影響，并與高溫高壓蒸汽滅菌法進行比較，探尋教學(xué)科研用離體牙的處理方法。

1 材料與方法

1.1 實驗牙的收集與分組

收集40顆因正畸拔除的前磨牙(患者年齡16～20歲)，要求牙體完整，無齲、無充填物及其他缺損。拔除后立即在流動水下用牙周刮治器去除附著的碎屑，然后用濕紗布包裹置于-20 ℃凍存，備用。將牙齒隨機分為兩組：高溫高壓蒸汽滅菌組和過氧化氫低溫等離子體滅菌組，每組20顆(10顆用于滅菌效果評價，10顆用于剪切粘接強度檢測)。另取10顆新鮮拔除的前磨牙，于30 min內(nèi)使用，作為剪切粘接強度實驗對照。

1.2 主要儀器與試劑

自酸蝕二步法粘接劑可樂麗SE Bond包括粘合用處理劑(批號1E0127)和粘合劑(批號190205)；可樂麗前后牙通用光固化復(fù)合樹脂A2 色(批號6P061)均為日本可樂麗則武齒科株式會社產(chǎn)品。OxoidTM營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(貨號CM0003B)、OxoidTM普通肉湯培養(yǎng)基(貨號CM0001B)、PBS(pH =7.4，貨號10010049)均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。金黃色葡萄球菌(ATCC6538)(編號1.2465)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。高溫高壓滅菌柜PYM712(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；過氧化氫低溫等離子體滅菌器LK/MJQ-100(成都老肯醫(yī)療科技股份有限公司)；垂直流潔凈工作臺JB-CJ-1500FX(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱MCO-15AC(日本三洋)；萬能試驗機AGS-500N(日本島津制作所)；低速精密切割機(上海萬衡精密儀器有限公司)；Spectrum 800光固化機(美國Dentsply 公司)；Leica M320 F12口腔手術(shù)顯微鏡(德國Leica)。

1.3 方法

1.3.1 滅菌方法 取出凍存的離體牙，濕紗布包裹，室溫下復(fù)溫30 min，用帶化學(xué)指示條的特衛(wèi)強袋卷封裝后進行消毒滅菌處理。高溫高壓蒸汽滅菌條件為：121 ℃/20 psi，40 min。低溫過氧化氫等離子體滅菌條件為：選擇標準程序，過氧化氫用量4 mL/次，滅菌艙工作溫度35～55 ℃，滅菌艙工作中最小真空度50 Pa，滅菌周期分為2次循環(huán)，共用時55 min。

1.3.2 滅菌效果評價 在超凈工作臺中無菌條件下進行。為檢測牙齒表面及髓腔內(nèi)滅菌效果，用無菌拔牙鉗將經(jīng)滅菌處理的牙齒夾開，暴露髓腔。細菌采樣及結(jié)果判定均根據(jù)《中華人民共和國醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》中對消毒滅菌的相關(guān)要求進行[8]。用浸有無菌0.03 mol/L PBS的棉拭子橫豎往返涂抹牙齒表面及髓腔各10次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，取樣范圍為牙齒全部表面及整個髓腔。將棉拭子(剪去手接觸部分)放入裝有10 mL無菌生理鹽水洗脫液的試管中。每一樣本洗脫液接種2個平皿，每個平皿接種1 mL。將45 ℃融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL傾注于已加入樣液的平皿中。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。檢測時同時設(shè)陰性、陽性對照組。陰性對照組：①用同批營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注平板直接培養(yǎng)；②分別吸取1 mL同批洗脫液與PBS各2份，分別接種于平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。陽性對照組：接種1 mL金黃色葡萄球菌(ATCC6538)18 h新鮮肉湯培養(yǎng)物于平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

結(jié)果判定：陽性對照組培養(yǎng)陽性，陰性對照組培養(yǎng)陰性，實驗組培養(yǎng)陰性，判定為滅菌合格；陽性對照組培養(yǎng)陽性，陰性對照組培養(yǎng)陰性，實驗組培養(yǎng)陽性，則滅菌不合格。每種滅菌方法，只要有一個樣本被判定為滅菌不合格，則認為該滅菌方法不適用于離體牙滅菌。

圖1 利用自制圓環(huán)在牙本質(zhì)面上粘接樹脂

1.3.4 剪切粘接強度測試 將試件固定在電子萬能測試機上，使剪切力方向與粘接面平行，試驗機壓頭正對樹脂柱。設(shè)置加載速度恒定為0.5 mm/min，樹脂柱脫落時，計算機顯示的最大值即剪切力值(N)，根據(jù)剪切粘接強度=剪切力/粘接面積，1 MPa=1 N/mm2，計算剪切粘接強度，以MPa表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。Kruskal-Wallis 檢驗比較總體樣本均數(shù)及Dunnett-t檢驗行兩兩比較，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

經(jīng)檢測，高溫高壓蒸汽滅菌組和低溫過氧化氫等離子體滅菌組的全部樣本滅菌結(jié)果均判定為合格，說明兩種滅菌方法均可用于離體牙消毒滅菌(圖2)。

a：高溫高壓組；b：低溫等離子體組；c：金黃色葡萄球菌(陽性對照)；d：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；e：洗脫液；f：PBS；d、e、f為陰性對照

剪切粘接強度測試結(jié)果見圖3。相比于對照組新鮮拔除的離體牙((64.37±4.88)MPa)，高溫高壓組((47.66±1.22)MPa)和低溫等離子體組((36.88±2.61)MPa)剪切粘接強度均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低溫等離子體組剪切粘接強度低于高溫高壓組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

在口腔醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中，相比于樹脂模塊牙，離體牙的解剖形態(tài)和硬度更接近于患者口腔內(nèi)的天然牙。學(xué)生使用離體牙進行牙體制備、根管治療等臨床技能操作培訓(xùn)時能夠更好地體會鉆磨天然牙時的手感。但是，離體牙含有大量病原微生物，具有空間傳染、急性傳染和潛伏性傳染等危險特征，且有機成分含量多，容易變質(zhì)。實習(xí)醫(yī)學(xué)生和使用離體牙從事研究工作的人員屬于可能接觸血源性病原體的主要人群之一。他們在進行操作培訓(xùn)時可能由于手接觸、吸入鉆磨牙齒時產(chǎn)生的粉末、噴濺的液體進入眼、口、鼻中而接觸到潛在的傳染性物質(zhì)。因此，醫(yī)學(xué)院一方面應(yīng)當(dāng)加強對醫(yī)學(xué)生及科研人員血源性病原體職業(yè)接觸防護的教育，另一方面，應(yīng)當(dāng)按照普遍預(yù)防的原則對應(yīng)用于教學(xué)、科研的離體牙進行滅菌。多種物理和化學(xué)消毒滅菌方法被嘗試處理離體牙，例如煮沸消毒法，季胺、5.25%次氯酸鈉、3%過氧化氫、2% 戊二醛、0.1%麝香草酚浸泡等。但多數(shù)研究結(jié)果表明，這些方法不能達到可靠的滅菌效果[9]。離體牙的牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)及牙髓組織當(dāng)中都可能存在病原菌，因此用于牙齒滅菌的方法應(yīng)不僅能使牙齒表面滅菌，還應(yīng)當(dāng)具有穿透性，能夠使深部的牙體硬組織及牙髓組織均達到滅菌效果。過氧化氫低溫等離子體滅菌技術(shù)的作用原理是：在一定真空度和溫度條件下注入含550 g/L以上過氧化氫溶液，經(jīng)過汽化、穿透、覆蓋到管腔器械的內(nèi)外表面，在45～55 ℃溫度協(xié)同下殺滅微生物；最后啟動等離子電源，一方面產(chǎn)生消毒因子協(xié)同作用達到最終滅菌水平，另一方面利用等離子體快速解離器械表面的過氧化氫變成水和氧氣，從而達到消除滅菌介質(zhì)殘留的作用[10]。低溫等離子體滅菌可以通過控制放電室的溫度，使其可以在常溫下進行，因此可以對不能用高溫高壓消毒的材料進行消毒，且效率高，時間短。另外產(chǎn)生等離子體的氣體可以完全采用無毒氣體，不會對人體和環(huán)境產(chǎn)生危害[8]。本實驗結(jié)果表明低溫等離子體滅菌技術(shù)亦可用于離體牙的滅菌處理。使用該項技術(shù)對有銀汞合金等充填物的離體牙進行滅菌處理時，既能夠避免甲醛的毒性，又能夠避免因高溫高壓導(dǎo)致充填材料分解帶來的危害[11]。因此，相比于高溫高壓蒸汽滅菌法，低溫等離子體滅菌技術(shù)在離體牙的滅菌處理方面適用范圍更加廣泛。

SD：標準差(standard deviation)；*：P<0.05

本次實驗中，相比于新鮮拔除的離體牙，經(jīng)高溫高壓滅菌處理后，粘接強度明顯下降。低溫等離子體組粘接強度下降更為明顯。離體牙的儲存方式和消毒滅菌方式影響粘接強度的確切機制尚不清楚。牙體硬組織的一個重要特性是顯微硬度。研究顯示：高溫高壓蒸汽滅菌可導(dǎo)致牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)顯微硬度明顯降低，掃描電鏡觀察見牙釉質(zhì)表面孔隙增加，開放的牙本質(zhì)小管數(shù)量增加[6]。有學(xué)者認為可能是由于較高的溫度和壓力導(dǎo)致牙本質(zhì)中有機成分變性，影響了牙本質(zhì)的顯微硬度[12]。有學(xué)者推測牙體硬組織顯微硬度的降低可能意味著牙體硬組織中無機物和(或)有機物的溶解或降解，從而導(dǎo)致牙本質(zhì)滲透性增加，并對粘接過程造成影響[13]。最近的研究顯示：高溫高壓蒸汽滅菌降低牙本質(zhì)滲透性66%，場發(fā)射掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)膠原纖維網(wǎng)塌陷[14]。離體牙滅菌方法對牙體硬組織中無機物含量、牙本質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)、牙本質(zhì)表面自由能等方面的影響還需深入研究，以揭示其對粘接強度影響的機制。本實驗中使用的低溫等離子體滅菌技術(shù)，雖然溫度和壓力都明顯低于高溫高壓蒸汽滅菌技術(shù)，但卻導(dǎo)致粘接強度下降最為顯著，這是否因牙齒中殘留的過氧化氫所導(dǎo)致還需進一步研究[15]。

患者年齡對牙本質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)、硬度和化學(xué)組成的影響表現(xiàn)為：隨著年齡的增長，牙本質(zhì)小管阻塞率、牙本質(zhì)的硬度和礦物質(zhì)的含量增加[16]。不同年齡組牙齒酸蝕后表面形態(tài)及粘結(jié)界面掃描電鏡觀察顯示：年輕恒牙組(牙根發(fā)育2/3～3/4)的混合層致密均勻，樹脂突密而長。青年恒牙組(25～40歲)混合層較年輕組疏松，厚度不均勻，樹脂突長度較均一。老年恒牙組(60歲以上)混合層疏松，薄厚不均，樹脂突較少且長度較短，并有樹脂突斷裂[17]。本次實驗使用的離體牙來自年齡16～20歲的患者,避免了因患者年齡跨度較大可能導(dǎo)致的實驗誤差。

綜上，本次實驗結(jié)果表明：高溫高壓蒸汽滅菌法和過氧化氫低溫等離子體滅菌技術(shù)均可用于教學(xué)用離體牙的滅菌處理，用于粘接強度實驗研究的離體牙不宜采用過氧化氫低溫等離子體滅菌技術(shù)滅菌。