DFeRB和SRB對冰封期鐵與硫還原的影響研究

宋文杰，石文靜，呂項蒙，呂思杰，呂昌偉，何江*

（1.內蒙古大學創業學院，呼和浩特010021；2.內蒙古大學生態與環境學院，呼和浩特010021）

鐵循環和硫循環是地球化學循環的重要組成部分，并且鐵與硫的生物地球化學行為緊密耦合。鐵和硫均具有較高的氧化還原敏感性，環境中氧化還原條件的改變對鐵和硫的生物地球化學行為具有重要影響。研究表明，微生物在鐵硫還原過程中起關鍵控制作用[1-7]。有兩大類微生物參與的代謝過程是推動環境中鐵循環和硫循環的重要環節，即異化鐵還原過程和硫酸鹽還原過程，而硫酸鹽還原菌和異化鐵還原菌則是這兩個過程的執行者[8-10]。

異化鐵還原和硫酸鹽還原在一定程度上共存且存在競爭，但并不完全互斥[11-12]。活性鐵是硫循環的重要參與元素，硫化物是氧化鐵的重要還原劑及氧化鐵還原溶解的關鍵因素[13]。還原環境中，硫酸鹽還原產生的硫化物可與活性鐵反應生成過渡產物硫化亞鐵，從而限制環境中鐵的活性[14-17]。當硫酸鹽還原受到抑制時，無機硫化物含量降低，并成為黃鐵礦形成的限制因素[18-19]。厭氧條件下，環境中異化鐵還原過程和硫酸鹽還原過程對碳、氮、磷等生源要素的循環和活性以及重金屬等污染物的形態和生物有效性有重要影響[20-27]。

與南方濕潤地區相比，北方冰封期普遍長達4～6個月，冰封期可能會切斷能量和物質交換，打破體系中原有的動態平衡。寒旱區湖泊溶解氧較低和復氧差等特殊的水文環境特征對鐵硫的生物地球化學行為有重要影響。因此冰封期微生物介導的異化鐵還原和硫酸鹽還原過程對鐵硫的環境地球化學行為研究具有重要意義。目前關于微生物對鐵硫環境地球化學行為的影響研究雖被廣泛關注，但關于冰封期微生物介導的異化還原作用對鐵硫生物地球化學行為的影響研究尚有不足。

本文采用室內模擬研究，分別開展了冰封期下異化鐵還原菌（DFeRB）和硫酸鹽還原菌（SRB）介導的還原過程對鐵硫生物地球化學行為的影響機制研究，探討冰封期微生物作用下鐵硫的耦合關系，評估冰封期微生物對鐵硫生物地球化學循環的貢獻，以期為冰封期下鐵硫循環研究提供基礎數據和科學依據，豐富不同環境特征下鐵硫循環的環境地球化學理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用的DFeRB和SRB分別為環境中廣泛存在且具有代表性的Shewanella putrefaciens和Desulfovibrio desulfuricanssubsp.desulfuricans。

試驗體系中的SO2-4和Fe3+分別為Na2SO4和FeCl3溶液，Na2SO4和FeCl3均為優級純，營養鹽溶液NH4Cl、KCl、CaCl2·2H2O、NaCl、MgCl2·7H2O和NaHCO3為分析純，乙酸鈉為分析純，試驗用水均為超純水。

試驗所用培養基、超純水、燒杯、槍頭等耐高溫用具在試驗前均于高壓滅菌鍋中進行滅菌，培養基121℃，30 min，其余為121℃、20 min。試驗所用注射器均為醫用無菌一次性使用注射器（帶針頭），其余不耐高溫用具試驗前均采用紫外線滅菌法進行滅菌，滅菌24 h以上，以保證滅菌效果。

1.2 試驗菌株和培養基

1.2.1 試驗菌株

Shewanella putrefaciens和Desulfovibrio desulfuricanssubsp.desulfuricans均購買自北納生物技術研究院。Shewanella putrefaciens屬γ-變形桿菌綱希瓦氏菌屬，兼性厭氧菌，易分離培養，生長快，分布廣，最佳生長溫度30℃（中溫菌），適宜pH值為中性。Desulfovibrio desulfuricanssubsp.desulfuricans屬脫硫弧菌屬，嚴格厭氧菌，是陰性弧性菌，適合生長溫度為30～37℃（中溫菌），生長pH范圍一般為5～9，適宜pH值為中性。

1.2.2 培養基

DFeRB和SRB的菌株為凍干粉，試驗前需進行活化富集并制備菌懸液。DFeRB的培養溫度為30℃，SRB的培養溫度為37℃。培養一段時間后，觀察菌種管內顏色變化，DFeRB培養液由紅棕色逐漸變為綠色或白色，表明該菌株具有還原鐵的能力。SRB培養至管壁變黑，形成黑色菌落，并伴有臭雞蛋氣味。

（1）DFeRB所用培養基

檸檬酸鐵培養基：NaCl 2 g·L-1、CaCl21 g·L-1、MgCl22 g·L-1、NH4Cl 3 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、檸檬酸鐵5 g·L-1，調節pH為7.2。

LB基礎固體培養基：牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、瓊脂15 g，調節pH為7。

LB基礎液體培養基：牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1，調節pH為7。

（2）SRB所用培養基

哥倫比亞血平板：購買即用型平板，購自環凱微生物有限公司。

富集培養基：NaCl 2 g·L-1、Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O 0.5 g、NH4Cl 1 g·L-1、NH4Cl 1 g·L-1、MgSO4·7H2O 2 g·L-1、Na2SO40.5 g·L-1、K2HPO40.5 g·L-1、乳酸鈉（70%）5 mL、酵母膏1 g·L-1，調節pH為7.5。

1.3 試驗設計

模擬冰封期于4℃條件下開展為期30 d的室內模擬試驗，試驗裝置采用100 mL螺口試劑瓶，設置無菌組為試驗對照組，分別構建Fe3++SRB、Fe3++DFeRB+SRB+DFeRB、Fe3++、Fe3+++SRB、Fe3+++DFeRB試驗體系。試驗用SRB為嚴格厭氧菌，培養基溶液用無氧水配置，該菌活化及富集過程中均通入氮氣以確保厭氧。所有試劑瓶在加入所需溶液后立即密封，所有操作在厭氧手套箱中進行。在培養的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、19、21、23、25、27、30 d時取樣，即時測定溶液中生物活性、Fe2+濃度和S2-濃度。

各試驗體系中Na2SO4和FeCl3的初始濃度均為10μmol·L-1。有菌組中，菌液接種量為4%（V/V）（即100 mL體系中添加4 mL菌懸液），添加乙酸鈉溶液為碳源，同時添加NH4Cl 0.25 g·L-1、NaCl 1 g·L-1、NaHCO32 g·L-1、KCl 0.5 g·L-1、MgCl2·7H2O 0.2 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.14 g·L-1為基礎營養鹽。

1.4 分析方法

（1）Fe2+濃度測定使用鄰菲羅啉比色法：樣品過0.22μm濾膜后，取濾液5 mL于比色管中（10 mL），加鄰菲羅啉溶液（0.5%，1 mL）和1 mL緩沖溶液，定容搖勻后，用紫外分光光度計于510 nm處測定Fe2+濃度。

（2）S2-濃度測定使用亞甲基藍分光光度法：樣品過0.22μm濾膜后，取濾液10 mL于比色管中（25 mL），加N，N-二甲基對苯二胺溶液2 mL（2 g·L-1）和硫酸鐵銨溶液1 mL（100 g·L-1），定容搖勻后，用紫外分光光度計于665 nm處測定S2-濃度。

（3）生物活性：取樣品（1 mL）于磷酸鈉緩沖溶液（pH=7.6，25 mL，60 mmol·L-1）中，振蕩2 h后，加入熒光素雙乙酸鹽（FDA）（0.1 mL，2 mg·mL-1），繼續振蕩2 h后于490 nm下比色，以吸光度值表征生物活性，同時取去離子水同樣操作為空白對照。

1.5 數據分析

本文中試驗數據用Excel 2016、OriginPro 2017進行處理和作圖，采用IBMSPSS25.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 DFeRB和SRB作用下的鐵硫還原

Fe3+與DFeRB和與SRB分別單獨存在時，Fe2+的濃度與DFeRB的生物活性及S2-的濃度與SRB的生物活性均存在顯著的正相關關系（P＜0.01，P＜0.05）（圖1），表明即使在低溫條件下，Fe3+和SO2-4的還原仍與微生物的生長耦合在一起。由圖2可知，在Fe3++DFeRB的試驗體系中，Fe2+的濃度隨培養時間的增加而呈現先增加后逐漸趨于平穩的趨勢；在+SRB的試驗體系中，S2-濃度隨培養時間呈波動式變化，并且培養前期的S2-濃度明顯高于后期，這可能與SRB的生物活性有關。由此可見，低溫下DFeRB和SRB仍具有一定的生物活性，DFeRB對Fe3+的異化還原和SRB對硫酸鹽還原仍具有明顯的促進作用。

2.2 SO2-4/Fe3+的添加對微生物介導的異化鐵還原和硫酸鹽還原過程的影響

圖1 Fe2+和S2-濃度與生物活性相關性Figure 1 The correlation analysis between Fe2+/S2-concentration and bioactivity

圖2微生物作用下的Fe3+異化還原和硫酸鹽還原以及兩者間的相互影響Figure 2 Fe3+reduction and sulfate reduction mediated by microbes and interaction between them

2.3 鐵硫共存體系中異化鐵還原和硫酸鹽還原的耦合關系

研究結果表明，低溫條件下，鐵硫共存時，還原產物Fe2+和S2-的生成仍然與DFeRB和SRB的生物活性緊密耦合在一起，DFeRB和SRB對Fe3+和的還原產生重要影響（圖4和圖5）。在只有Fe3+和存在時，鐵硫得電子摩爾濃度矩陣分布較為簡單，且在陰影區范圍內呈現明顯負相關關系（圖6），表明在化學介導還原過程中的還原可能存在被Fe3+抑制的風險[28]。而微生物存在時鐵硫得電子摩爾濃度矩陣分布情況則相對復雜（圖6），這也進一步表明當鐵硫共存時，DFeRB和SRB的存在使得體系中鐵硫自身的電子傳遞受到影響，Fe3+和的還原過程更為復雜[29-30]。

對比Fe3+++DFeRB與Fe3++體系（圖5），Fe2+濃度變化規律在培養的不同時段明顯不同，這可能與微生物作用下鐵硫競爭電子有關，表明即使低溫條件下DFeRB對于存在競爭電子關系的Fe-S共存體系中Fe3+和的還原仍具有不可忽視的影響。具體而言，培養前期個別時段內DFeRB作用下的Fe2+濃度高于無菌組，表明DFeRB作用下的Fe3+還原快于無菌組中Fe3+和的化學介導還原；培養中期基本呈現為無菌組高于DFeRB組，是由于Fe3+在DFeRB作用下雖可被迅速還原，但隨后還原產生的S2-可與Fe2+反應消耗部分Fe2+。隨培養時間的增加，在DFeRB組鐵硫爭奪電子的過程中，硫的電子總量明顯高于鐵（圖7），表明在后期有明顯的硫酸鹽還原反應發生還原產生的HS-可間接還原Fe3+，并且無菌組中Fe3+和及其還原產物不斷發生化學吸附-解吸反應，因而在培養后期出現個別時段內DFeRB作用下的Fe2+濃度高于無菌組。就S2-濃度而言，鐵硫共存體系中，雖然無菌組中硫的電子量明顯高于鐵，硫酸鹽還原占主導，但DFeRB作用下的S2-濃度明顯高于無菌組（圖5和圖7），表明DFeRB的還原作用明顯強于化學介導還原。Fe3+和在無菌組中通過化學介導還原產生的Fe2+和S2-不斷發生化學反應產生FeS等沉淀，因而S2-維持在較低濃度水平；而在DFeRB存在時，雖然還原產物Fe2+和S2-也會發生反應，但在DFeRB的異化還原作用下，Fe3+和不斷被還原，還原產物不斷生成。

圖3 Fe2+及S2-濃度三元圖Figure 3 Ternary diagramof Fe2+and S2-concentration

圖4鐵硫共存時Fe2+和S2-濃度與生物活性相關性Figure 4 The correlation analysis between Fe2+/S2-concentration and bioactivity in iron and sulfate coexist system

圖5鐵硫共存體系中微生物的還原作用Figure 5 The reduction mediated by microbes in iron and sulfate coexist system

圖6鐵硫共存體系中鐵硫得電子量相關性Figure 6 The correlation analysis between gained electrons of Fe and Sin iron and sulfate coexist system

鐵硫共存體系中，SRB作用下硫的得電子總量明顯高于鐵（圖7），表明Fe3+和同時存在時，SRB優先還原。Fe3+++SRB與Fe3++體系中，Fe2+濃度在兩組間總體差異不大，但SRB作用下的Fe2+最大濃度明顯較無菌組高（圖5）。S2-濃度在兩組間變化趨勢雖基本一致（圖5），但鐵硫得電子摩爾濃度矩陣分布情況明顯不同，且SRB作用下的電子分布情況更為復雜（圖6）。這在一定程度上說明鐵硫共存體系中SRB存在下的鐵硫還原的反應過程較為復雜。鐵硫的得電子量在S2-濃度小于0.07 mg·L-1時呈明顯負相關（圖6），表明在一定濃度范圍內，Fe3+的存在會抑制的還原[28]，并且S2-存在下鐵會以FeS的形式析出，S2-濃度會因鐵的存在而下降。在S2-濃度在0.07～0.075 mg·L-1范圍內，Fe2+濃度短時間內得到累積，可能是由于在SRB作用下產生的還原產物一定程度上累積，以Fe3+形式存在的鐵易被還原[31]。S2-濃度超過0.075 mg·L-1后，鐵硫得電子量呈正相關，表明此時溶解性鐵的濃度可能超出了S2-的保護機制[28]，且當S2-濃度較高時可能有利于化學還原的發生。

圖7鐵硫共存體系中鐵和硫的得電子量Figure 7 The gained electrons of Fe and Sin iron and sulfate coexist system

Fe3+++SRB與Fe3+++DFeRB中的Fe2+濃度見圖8，整體而言，SRB介導還原生成的Fe2+濃度雖高于DFeRB，但DFeRB作用下鐵的得電子總量高于SRB，表明DFeRB更傾向于與Fe3+交換電子，更有利于Fe3+的還原。分階段來看，反應前期（1～7 d），尤其是1～2 d時，以及反應后期（19～30 d）DFeRB介導還原生成的Fe2+濃度顯著高于SRB（P＜0.05），而反應中期（8～17 d）SRB介導還原生成的Fe2+濃度卻顯著高于DFeRB（P＜0.05）。就S2-濃度而言（圖9），反應前期（1～6 d）SRB介導生成的S2-明顯高于DFeRB，而中后期（7～30 d）DFeRB介導生成的S2-卻高于SRB（P＜0.01）。這再次證實鐵硫共存時，SRB更易與交換電子，促進的還原，且的還原作用優于Fe3+的還原。但中后期SRB作用下的S2-生成濃度低于DFeRB組，可能與鐵硫的成礦作用有關，此外有研究表明細胞產量和最大生長率隨S2-濃度的升高而降低，因而后期SRB的還原能力也較前期弱。

圖8鐵硫共存體系中DFeRB和SRB作用下不同階段Fe2+濃度Figure 8 Fe2+concentration mediated by DFeRBand SRBin iron and sulfate coexist system

圖9鐵硫共存體系中DFeRB和SRB作用下不同階段S2-濃度Figure 9 S2-concentration mediated by DFeRBand SRBin iron and sulfate coexist system

3 討論

3.1 SO2-4/Fe3+的添加對微生物介導的異化鐵還原和硫酸鹽還原的影響研究

在Fe3+與DFeRB單獨存在時，培養前期還原產生的Fe2+濃度較中期高，這是由于在培養初期DFeRB適應試驗培養環境后，利用體系中的乙酸鈉為電子供體，快速還原Fe3+，Fe2+濃度明顯累積，隨培養時間的增加，受電子供體和電子受體含量的限制，Fe3+的還原受到抑制，Fe2+的生成速率逐漸減慢，累積量逐漸趨于平穩。本研究結果表明，DFeRB也可直接還原，并且一定濃度范圍內的添加可以促進異化鐵還原過程中Fe2+的累積，且Fe3+與共存時，更有利于Fe3+的異化還原。這可能是由于在Fe3+與同時存在時，Fe3+與會爭奪電子，因而有部分Fe2+可能來源于還原產生的HS-介導的間接還原產物。同時也有研究發現相當一部分的溶解性Fe2+是HS-介導的間接還原的產物[32]，這與本研究的結果一致。但是，DFeRB作用下Fe3+的異化還原也會受到高濃度S2-的抑制，因而本研究部分培養時期內Fe3+、及DFeRB共存時的Fe2+濃度與Fe3+及DFeRB單獨存在時的Fe2+濃度差異不大。Fe3+、及SRB共存時與不添加時的Fe2+濃度在培養周期內整體差異較小，這可能是由于盡管低溫條件下SRB也可直接還原Fe3+，但在存在的情況下，SRB優先還原，因而Fe3+與共存時，SRB并沒有明顯促進體系中Fe2+的累積。

3.2 鐵硫共存體系中異化鐵還原和硫酸鹽還原過程研究

鐵硫共存時，兩者之間會相互干擾，Fe3+和不只是電子數量的競爭者，更是微生物細胞內部電子傳遞途徑的競爭者[34]。因而鐵硫共存時，DFeRB和SRB的存在使得體系中鐵硫自身的電子傳遞受到影響，Fe3+和的還原過程更為復雜。本研究結果證明即使低溫條件下DFeRB對于存在競爭電子關系的Fe-S共存體系中Fe3+和的還原仍具有不可忽視的影響。鐵硫共存時，DFeRB驅動的Fe3+還原明顯快于無菌條件下Fe3+和的化學介導還原，但同時體系中Fe2+濃度會受到S2-濃度的影響，雖然Fe3+在DFeRB作用下可被迅速還原，但隨后還原產生的S2-可與Fe2+反應消耗部分Fe2+，使得Fe2+濃度降低，但后期由于的存在有明顯的硫酸鹽還原反應發生，還原產生的HS-也可間接還原Fe3+，還原產物Fe2+增多。鐵硫共存時，DFeRB作用下的S2-濃度高于無菌組，這也證明DFeRB驅動的還原作用明顯強于化學介導還原。有研究表明[35]微生物驅動的鐵的還原溶解會降低甚至失去其自身的吸附能力，還原產生的Fe2+可與釋放的其他元素比如磷、重金屬等競爭環境中的其他吸附位點。這也表明即使低溫條件下，DFeRB和SRB驅動的異化還原過程也會對碳、氮、磷等生源要素的循環和活性以及重金屬等污染物的形態和生物有效性等產生重要影響。

在Fe3+、及DFeRB共存時，Fe2+濃度日漸累積而S2-濃度下降的階段出現可能是因為在DFeRB作用下發生異化鐵還原，同時吸附在Fe3+上的復合硫化物與Fe3+之間也可發生電子轉移從而導致Fe3+還原[36]，這也表明在DFeRB作用下的鐵硫共存體系中Fe3+還原的機制不只一種，而是包括以H+作為電子供體的直接微生物還原、通過S2-和HS-作用于Fe3+的間接還原以及以乳酸鈉為碳源的直接微生物還原等多種發生機制。同時也有研究表明[37]，異化鐵還原過程包含多種還原機制，例如通過細胞外膜蛋白與Fe3+接觸直接傳遞電子的直接接觸機制、通過產生細胞附屬物與Fe3+接觸傳遞電子的導電附屬物機制、通過小分子絡合物與Fe3+作用的螯合機制以及電子穿梭體機制等。體系中出現Fe2+和S2-濃度同時下降階段，是因為在DFeRB作用下的鐵硫共存體系中，DFeRB會迅速作用于Fe3+，之后獲得電子，S2-得到累積并達到較高濃度，而游離的Fe2+可與S2-生成FeS沉淀。Fe2+濃度降低而S2-相對穩定的階段可能是由于FeS到FeS2的轉化[38]，并且FeS2的生成可以減少HS對微生物細胞的毒性，因而此時Fe2+濃度的下降對SO2-4的還原起到一定的協同作用[33]。

本研究結果證明Fe3+、及SRB共存時，SRB優先還原SO2-4。SRB作用下的Fe2+濃度較Fe3+與單獨存在時的總體差異不大，但SRB作用下的Fe2+最大濃度明顯較高，這是因為Fe3+在SRB還原后可競爭得到部分電子進而被SRB直接還原，并且還原產生的HS-也可間接介導Fe2+的生成，但是SRB作用下大量生成的S2-與Fe2+反應[39]，一定程度上會限制Fe2+的含量。

在Fe3+、及DFeRB或SRB共存時，SRB更易與交換電子，促進的還原，且的還原作用優于Fe3+的還原。DFeRB更傾向于與Fe3+交換電子，更有利于Fe3+的還原。培養中后期SRB作用下的S2-生成濃度低于DFeRB組，可能與鐵硫的成礦作用有關，此外有研究表明細胞產量和最大生長率隨S2-濃度的升高而降低，因而后期SRB的還原能力也較前期弱。反應前期（1～7 d）及后期（19～30 d）DFeRB介導還原生成的Fe2+濃度顯著高于SRB，而反應中期（8～17 d）SRB介導還原生成的Fe2+濃度卻顯著高于DFeRB。這是由于DFeRB可更快地與Fe3+交換電子，誘導Fe3+的還原，到反應中期，除微生物直接還原Fe3+外，雖然DFeRB作用下鐵硫共存體系中也可生成還原產物，但SRB作用下S2-和HS-的累積量更高，間接介導生成的Fe2+更多，因而SRB介導還原生成的Fe2+濃度更高，但到后期SRB組中S2-與Fe2+反應，一定程度上又限制了Fe2+的生成。

4 結論

（1）本研究結果表明，即使在冰封期，DFeRB和SRB仍具有一定的生物活性，對鐵的異化還原以及硫酸鹽還原仍有明顯的促進作用，并且和Fe3+可以分別作為DFeRB和SRB的直接電子受體，無需化學中間產物的介導。

（3）冰封期，鐵硫共存時，DFeRB和SRB對Fe3+和的還原具有重要影響，并且DFeRB和SRB的存在使得體系中鐵硫自身的電子傳遞受到影響，Fe3+和的還原過程更為復雜。鐵硫共存時DFeRB對鐵的影響程度強于SRB。無論是DFeRB還是SRB，Fe3+和還原菌同時存在時對還原的促進作用更強。不同微生物的還原傾向性和生物可利用性存在明顯區別，DFeRB更傾向于與Fe3+交換電子，更有利于Fe3+的還原；SRB更易與交換電子，更能促進的還原，但是鐵硫共存時DFeRB中鐵硫得電子量更大。DFeRB和SRB介導下的鐵還原和硫還原存在明顯的耦合關系，且存在顯著的階段性差異，并且一定程度上的還原優于Fe3+的還原。