UPLC-MS/MS直接進樣快速測定水體中41種初級芳香胺

王璐，賀澤英，孫小杰，史小萌，何沛橋，王策，劉瀟威*

（1.農業農村部農產品質量安全環境因子控制重點實驗室/農業農村部環境保護科研監測所，天津300191；2.SCIEX公司，上海200335）

初級芳香胺（Primary aromatic amines，PAAs）是一類典型的有毒有害化合物，其中最簡單的形式是苯胺。苯胺類化合物系指苯胺分子中的氫原子被其他功能團取代后形成的一類化合物，是染料工業的重要原料，其被廣泛應用于印染、橡膠、制藥、油漆、農藥和人造樹脂等工業生產中。環境中所含的苯胺類化合物主要來自制藥和染料工作廢水、含有硝基苯的礦山酸性廢水在有鋅粉和銅鹽存在的條件下生成的廢水、有色金屬選礦廠廢水等。苯胺類化合物能通過呼吸道、皮膚、腸道等途徑進入人體，其不僅能使氧合血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白從而降低血液的載氧能力，使組織細胞缺氧而窒息，造成中樞神經系統、心血管系統和其他臟器損傷，而且還具有較強的致癌作用[1]。美國于1976年公布清潔水法，將聯苯胺納入129種優先監測污染物列表[2]，我國現行的地表水環境質量標準中，將苯胺和聯苯胺列為集中式生活飲用水地表水源地特定項目[3]。因此，建立一種快速便捷、靈敏準確的水中多種初級芳香胺同時測定的分析方法，對監控環境中初級芳香胺的排放具有重要的現實應用意義。

近年來，針對水樣中苯胺類化合物檢測技術的研究越來越多，檢測方法日臻成熟，目前主要有分光光度法[4-5]、熒光光度法[6-7]、毛細管電泳法[8]、氣相色譜法[9-11]、液相色譜法[12]、質譜聯用法[13-14]等，另外前處理技術與儀器設備聯用的方法也有報道，如吹掃捕集與色譜及質譜聯用方法[15]、固相微萃取與色譜及質譜聯用方法[16-17]等。不同的檢測方法在靈敏度、前處理復雜程度、分析時間長短等方面有著各自的優勢和不足，并且均在不斷地改進與發展。本文探討建立了一種使用高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀，采用直接進樣方式快速測定水體中41種初級芳香胺化合物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

Qtrap 4500串聯質譜系統和ExionLC液相色譜（美國SCIEX公司）；Phenomenex Kinetex F5液相色譜柱（五氟苯基固定相，2.6μm，3 mm×100 mm，博納艾杰爾公司）；甲醇（色譜純，Fisher）；甲酸（色譜純，Aladdin）；實驗用水為實驗室一級水；0.22μm濾膜（美國PALL）；41種初級芳香胺化合物標準品（天津阿爾塔科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

根據41種初級芳香胺化合物的純度和標準溶液配制體積，準確稱取一定量標準品，用甲醇溶解并定容后，制備成濃度為100 mg·L-1的標準儲備溶液。準確吸取一定量各初級芳香胺化合物標準儲備溶液，混勻并用甲醇定容后，制備成不同濃度的初級芳香胺化合物混合標準工作溶液。

1.2.2 實驗樣品制備

通過向實驗用水中定量添加初級芳香胺化合物混合標準工作溶液制備實驗樣品。

1.2.3 樣品前處理方法

實驗樣品混合均勻后，過0.22μm濾膜，直接上機測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件

流動相A為0.05%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，流速為0.45 mL?min-1，梯度洗脫程序見表1。

時間Time/min 0578 8.1 12流動相A Mobilephase A/%90 10 559 0 90流動相BMobilephase B/%10 60 95 95 10 10

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；離子源溫度：600℃；離子化電壓：2 000 V；氣簾氣壓力：30 psi（1 psi=6.895 kPa）；噴霧氣壓力：9 psi；霧化氣（GS1）壓力：40 psi；輔助氣（GS2）壓力：50 psi；檢測方式：多反應監測（MRM）。41種初級芳香胺多重反應監測的串聯質譜條件見表2。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

本實驗中，初級芳香胺化合物數量較多，極性分布范圍較寬，間苯二胺、苯胺等化合物極性較強，故需對色譜柱進行優化選擇，以確保各化合物既有良好的保留行為以及峰型，又有較好的分離效果。選擇Phenomenex Omega、Phenomenex Kinetex F5和Waters HSST3這3款針對極性化合物檢測常用的液相色譜柱進行對比發現，采用五氟苯基丙基固定相的KinetexF5色譜柱對41種化合物均有較好的色譜保留和分離效果（圖1），同時也能有效分離4對同分異構體（序號分別為11-12、13-14、22-23和36-37），因此最終選擇了Kinetex F5色譜柱作為本實驗的分離色譜柱。

表2 41種初級芳香胺多重反應監測的串聯質譜條件Table 2 UPLC/ESI-MS/MSparameters for 41 PAAs in MRM mode

2.1.2流動相的選擇

基于初級芳香胺化合物稍溶于水、易溶于有機溶劑的理化性質，本實驗考察了甲醇-水和乙腈-水兩個液相色譜常用流動相體系。通過靈敏度實驗，發現在甲醇體系里，所有化合物靈敏度均優于在乙腈的體系中，故而選擇甲醇作為洗脫相。實驗發現，流動相中甲醇初始比例的不同對極性較強的化合物靈敏度有非常大的影響，甲醇含量越高，化合物的靈敏度越高，但同時造成部分同分異構體不能完全分離。因此，在兼顧靈敏度和分離度的前提下，選擇了10%的甲醇作為流動相的初始比例。同時，考慮到質譜正離子模式下，甲酸可使化合物形成[M+H]+峰，有助于促進離子化，提高分析靈敏度，因此實驗比較了0、0.01%、0.05%、0.1%和0.2%5個不同濃度甲酸溶液對化合物靈敏度的影響，結果發現甲酸濃度為0.05%時，所有化合物的響應值均已能夠滿足方法定量限的要求（圖1），因此最終固定水中甲酸濃度的添加水平為0.05%。

2.2 質譜條件的優化

本實驗采集模式為多反應監測（MRM）模式，通過全掃描模式確定41種初級芳香胺化合物的保留時間及高強度的一級離子，選擇高強度一級離子作為母離子，分別對其進行不同碰撞能量的電離轟擊試驗，通過主要離子碎片的相對離子豐度確定最佳碰撞能量。各組分保留時間及MRM條件見表3。同時，為了獲得最佳的靈敏度，本實驗對離子源參數部分進行了詳細優化，在進行離子源噴霧電壓優化時發現，不同電壓下，41種芳香胺化合物的靈敏度有較大差異。最終發現，當電壓設定為2 000 V時，所有化合物的靈敏度都是最佳，見圖1。

2.3 方法學驗證

針對建立的檢測方法開展添加回收率實驗，添加濃度為5μg·L-1。結果表明，41種初級芳香胺化合物的回收率范圍為64.2%～110.3%，其中39種化合物的回收率＞80%。另外，通過在實際空白水體樣品中添加濃度分別為0.1、5、20μg·L-1的初級芳香胺化合物標準品，開展方法重現性實驗。實驗結果顯示，41種初級芳香胺化合物的相對標準偏差（RSD）均在2.31%～7.90%。同時，不同時間下測得41種初級芳香胺化合物的日間重現性（相對標準偏差RSD）均在2.60%～8.11%。表明本方法具有良好的準確性和重現性，能夠滿足水體中初級芳香胺化合物的測定要求。

本方法在0.08～50μg·L-1濃度范圍內具有良好的線性，41種初級芳香胺的相關系數為0.989 9～0.999 8。取3倍和10倍信噪比所對應的初級芳香胺濃度作為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），41種化合物的LOD和LOQ分別在0.01～0.15μg·L-1和0.04～0.3μg·L-1范圍內。

2.4 實際樣品驗證

采集北京地區10個不同的地表水樣品進行測定，均未檢出41種初級芳香胺化合物，說明目前該地區尚未受到此類化合物的污染，日后將進一步擴大采樣范圍，對地表水源進行此類化合物的篩查分析研究。

圖1 41種初級芳香胺總離子流圖（0.05%甲酸、離子源噴霧電壓2 000 V條件下）Figure 1 TICof 41 PAAs（0.05%formic acid，ion source spray voltage 2 000 V）

表3 41種初級芳香胺化合物準確度和重現性實驗結果Table 3 Experimental results on the accuracy and reproducibility of 41 PAAs

表4 41種初級芳香胺化合物線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Table 4 Linear range，correlation coefficient，LODand LOQof 41 PAAs

3 結論

本研究建立了水體中41種初級芳香胺化合物的UPLC-MS/MS快速檢測方法。水體樣品未經凈化，直接過膜后超高效液相色譜-串聯質譜儀檢測。該方法線性關系良好，準確度和精密度高，分析時間短，通量高，目標物覆蓋范圍廣，操作極為簡便。