辣木葉多酚提取物對(duì)光老化小鼠皮膚的保護(hù)作用

孫麗平，李鵬程，莊永亮，孫云

(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院， 云南 昆明， 650500)

紫外線(ultraviolet，UV)照射是引起皮膚光老化的重要因素。一方面，UV照射產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen speccies，ROS)，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而提升皮膚中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的分泌；另一方面， UV照射加速了促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，刺激MMPs的產(chǎn)生[1-2]。MMPs含量的增加加速了皮膚中膠原蛋白基質(zhì)的降解[3]，易引發(fā)皮膚的光老化。目前，抑制皮膚光老化的途徑主要集中在紫外線屏蔽、紫外線吸收和各種抗氧化劑和抗炎因子等。

辣木(MoringaoleiferaLam.)是辣木科辣木屬植物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉中多酚類物質(zhì)含量豐富，具有較好的生物活性[5-9]。

先前我們對(duì)云南產(chǎn)辣木葉多酚提取物(Moringaoleiferaleaves extracts，MLE)進(jìn)行了提取和體外活性研究[10]。研究發(fā)現(xiàn)，MLE中多酚類物質(zhì)的含量為20.16 mg/g干重， 其中39種化合物被分離鑒定；同時(shí)，MLE顯示了較好的體外抗氧化、抑菌和抗炎作用。根據(jù)MLE的體外生物活性，本文進(jìn)一步研究MLE對(duì)光老化小鼠皮膚的影響。通過(guò)分析MLE對(duì)光老化皮膚主要組成、氧化應(yīng)激、MMPs及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，評(píng)價(jià)MLE對(duì)光老化小鼠中皮膚的潛在保護(hù)作用，旨在為辣木葉多酚生理活性的深入挖掘及產(chǎn)品應(yīng)用開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)毛小鼠(雄性，BALB/c，體重20～22 g)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；辣木葉，由云南天佑科技開發(fā)有限公司提供；蛋白質(zhì)(protein，Prot)濃度、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量等測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)含量、MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-9)含量等測(cè)定ELISA試劑盒，購(gòu)于R&D公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-20B高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；SpectraMax Ms多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；Olympus DP70光學(xué)電子顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣木葉多酚提取物的制備

準(zhǔn)確稱取20 g辣木葉樣品，加入100 mL提取混合液[V(丙酮)∶V(水)∶V(乙酸)=70∶29.7∶0.3]，混勻，超聲波處理5 min，靜置20 min，再超聲5 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液，重復(fù)以上步驟2次，混合提取的上清液，45 ℃旋蒸濃縮，冷凍干燥，所得樣品(MLE)儲(chǔ)存于干燥器中備用。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理

無(wú)毛小鼠30只，動(dòng)物飼養(yǎng)按照標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的飲食和水處理，所有小鼠適應(yīng)新環(huán)境1周。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為3組，每組有10只，包括：正常對(duì)照組(normal control group，NC)，無(wú)UV照射，灌胃生理鹽水；模型對(duì)照組(model control group，MC)，UV照射，灌胃生理鹽水；MLE組，UV照射，灌胃MLE提取物，樣品劑量為150 mg/(kg·d)。

1.3.3 UV照射

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前，測(cè)定UVA和UVB照射小鼠皮膚的最小紅斑劑量(minimal erythema dose，MED)，確定了UVA和UVB的MED分別為127.84和18.36 mJ/cm。實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行UV照射，每周3次，共10周。第1周的照射強(qiáng)度為0.5 MED，每周增加0.5 MED，最高達(dá)到4 MED，以4 MED照射小鼠3周。

1.3.4 皮膚的定量指標(biāo)分析

對(duì)皮膚中HYP含量、HA含量、蛋白質(zhì)濃度，SOD活性，GSH-Px活性，CAT活性，GSH含量、MDA含量及MMPs含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒的要求。

1.3.5 皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

將小鼠背部皮膚標(biāo)本(約1 cm×1 cm)在中性緩沖福爾馬林溶液(40 g/L)中固定24 h。利用蘇木素-伊紅(H&E)染色和Van Gieson(VG)染色對(duì)小鼠皮膚的一般組織形態(tài)和膠原結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)定10個(gè)平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；使用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以最小顯著差異法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚中HYP和HA含量

長(zhǎng)期暴露在紫外線照射下會(huì)導(dǎo)致皮膚成分發(fā)生變化。膠原蛋白和HA是皮膚中的2種重要成分，在皮膚功能中起著關(guān)鍵作用。膠原降解和損傷是光老化的主要特征。抑制膠原蛋白的產(chǎn)生和促進(jìn)膠原蛋白的降解是UV照射破壞皮膚膠原蛋白基質(zhì)的2個(gè)主要途徑[11]。HYP是膠原蛋白中的一種特殊氨基酸，因此HYP含量經(jīng)常被用作衡量皮膚膠原蛋白含量的指標(biāo)[12]。如圖1-A所示，UV照射可極顯著降低皮膚中HYP含量(P<0.01)，相對(duì)于NC組，MC組小鼠皮膚的HYP含量下降了51.21%。攝入MLE后，小鼠皮膚中HYP含量顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明MLE可以有效地增加皮膚中膠原蛋白的含量。HA的基本結(jié)構(gòu)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成的大分子，不含硫多糖。HA具有良好的結(jié)合水能力，對(duì)皮膚的水分維持和彈性保持有重要作用；同時(shí)，HA能夠支撐皮膚的擴(kuò)張結(jié)構(gòu)，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物在皮膚中的擴(kuò)散[13]。如圖1-B所示，UV照射導(dǎo)致皮膚中HA含量顯著下降(P<0.01)，表明光老化皮膚的表皮層存在損傷。攝入MLE后，小鼠皮膚中HA含量顯著增加(P<0.05)。相對(duì)于MC組，MLE組小鼠皮膚的HA提高了39.16%，該結(jié)果顯示，光老化小鼠的表皮層得到一定程度的修復(fù)。

2.2 皮膚中抗氧化酶的活性

氧化應(yīng)激是UV誘導(dǎo)皮膚光老化過(guò)程中的關(guān)鍵因素。UV照射導(dǎo)致皮膚損傷常常來(lái)自于活性氧的產(chǎn)生[14-17]。皮膚中存在抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶(例如SOD、CAT和GSH-Px)和非酶小分子(例如GSH)。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫；CAT是存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物體內(nèi)，能夠催化過(guò)氧化氫分解成氧和水；GSH-Px可以促進(jìn)過(guò)氧化氫與GSH反應(yīng)生成H2O和氧化型谷胱甘肽。小鼠皮膚中抗氧化酶活性的變化如圖2所示。與NC組相比，UV照射使皮膚中SOD和GSH-Px的活性極顯著降低(P<0.01)，CAT活性顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，UV照射降低了皮膚中SOD、CAT和GSH-Px的活性，從而降低了ROS的清除能力，增加了皮膚的氧化應(yīng)激。與MC組相比，MLE組的小鼠皮膚中SOD活性極顯著增加(P<0.01)，CAT和GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果表明，MLE可抑制UV照射導(dǎo)致的SOD、CAT和GSH-Px活性的下降，從而有效地提升皮膚抑制ROS所產(chǎn)生氧化應(yīng)激的能力。

A-HYP含量；B-HA含量圖1 MLE對(duì)小鼠皮膚中HYP和HA含量的影響Fig.1 Effects of MLE on contents of HYP and HA in mice skin注： *表示組間差異顯著(P<0.05)；**表示組間差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.3 皮膚中GSH和MDA含量

GSH是皮膚中具有抗氧化能力的非酶小分子物質(zhì)，GSH濃度的提高可以有效地緩沖皮膚的抗氧化能力。小鼠皮膚中GSH含量的變化如圖3-A所示，與NC組相比，UV照射極顯著地降低了GSH含量(P<0.01)，MC組小鼠皮膚中GSH含量為NC組的57.32%。與MC組相比，MLE組的小鼠皮膚中GSH含量顯著增加(P<0.05)。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的典型產(chǎn)物，因此，MDA經(jīng)常被用來(lái)評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[18]。小鼠皮膚中MDA含量的變化如圖3-B所示，與NC組相比，UV照射極顯著地提高了MDA含量(P<0.01)，MC組小鼠皮膚中MDA含量為NC組的2.42倍。MLE可以降低MDA含量，相對(duì)于MC組，MLE組小鼠皮膚的MDA下降了42.24%。我們先前的研究表明，MLE富含有多酚類物質(zhì)，具有較好的體外抗氧化能力，可抑制自由基的形成[10]。因此，MLE對(duì)光老化皮膚抗氧化體系的保護(hù)原因可歸結(jié)為MLE的多酚組成及其較高的抗氧化能力。

2.4 皮膚中MMPs含量

MMPs是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的鋅依賴性內(nèi)肽酶。根據(jù)結(jié)構(gòu)和底物特異性差異可分為不同的亞組[19]。MMP-1、MMP-3和MMP-9分別屬于膠原酶、間質(zhì)溶解素和明膠酶。研究表明，MMPs是導(dǎo)致皮膚膠原降解的主要分解酶，MMPs水平可有效反映皮膚中膠原蛋白的損傷程度。MMPs的表達(dá)可由UV照射產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[20]。小鼠皮膚中MMPs含量的變化如圖4所示。UV照射誘發(fā)皮膚中MMPs的含量極顯著增加(P<0.01)，與NC組相比，MC組小鼠皮膚中MMP-1，MMP-3和MMP-9的含量分別增加了87.55%，65.31%和274.57%。與MC組相比，MLE對(duì)光老化小鼠皮膚中MMP-1的含量有極顯著的降低作用(P<0.01)，對(duì)MMP-3和MMP-9的含量有顯著的降低作用(P<0.05)。這些結(jié)果表明，攝入MLE后，皮膚中的MMPs的水平顯著降低，從而有效地保護(hù)了皮膚中的膠原蛋白。結(jié)合先前的研究[10]，MLE的體外抗氧化活性和抗炎作用介入對(duì)光老化皮膚MMPs含量的抑制作用。

A-GSH含量；B-MDA含量圖3 MLE對(duì)小鼠皮膚GSH和MDA含量的影響Fig.3 Effects of MLE on the contents of GSH and MDA in mice skin

A-MMP-1含量；B-MMP-3含量；C-MMP-9含量圖4 MLE對(duì)小鼠皮膚中MMPs含量的影響Fig.4 Effects of MLE on MMPs contents in mice skin

2.5 皮膚的組織形態(tài)和膠原結(jié)構(gòu)

表皮層和真皮層是皮膚的2個(gè)主要部分[21]。表皮層是機(jī)體高效的物理屏障，保護(hù)皮膚免受環(huán)境影響的關(guān)鍵組織；膠原蛋白是真皮層的主要組成部分。形態(tài)組織學(xué)分析表明，表皮厚度和膠原結(jié)構(gòu)變化是UV誘導(dǎo)皮膚光老化的主要特征。UV照射可以通過(guò)激活表皮生長(zhǎng)因子受體以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為表皮增生；同時(shí)，表皮增生可以保護(hù)皮膚抵制UV照射，這可作為皮膚對(duì)UV照射的適應(yīng)性反應(yīng)[22]。H&E染色可表達(dá)小鼠皮膚的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)。如圖5-A所示，在H&E染色圖中，NC組小鼠中表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層纖維組織呈波浪狀且分布均勻，方向與表皮平行。與NC組相比，MC組小鼠的光老化皮膚存在表皮層厚度增加伴有角化過(guò)度、真皮層組織稀疏、皮脂腺不規(guī)則增生等現(xiàn)象。與MC組相比，MLE一定程度上修復(fù)了光老化小鼠皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)，真皮層中的纖維更加組織和致密，皮脂腺增生有效改善。結(jié)果表明，經(jīng)UV照射后，小鼠皮膚的表皮層顯著增厚。經(jīng)MLE干預(yù)后，光老化皮膚的表皮增厚得到有效的恢復(fù)。

UV照射可導(dǎo)致真皮層組織稀疏、纖維分布不均、膠原纖維被破壞等。VG染色可以看出皮膚中膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化。如圖5-B所示，在VG染色圖中，NC組小鼠皮膚膠原排列致密有序、分布均勻、呈波浪狀。與NC組相比，MC組小鼠皮膚膠原纖維排列松弛無(wú)序，存在一定的膠原蛋白斷裂沉積現(xiàn)象。與MC組相比，MLE組小鼠皮膚膠原纖維分布均勻、出現(xiàn)波浪形狀、排列呈現(xiàn)一定的有序化。這些結(jié)果表明，MLE可有效的修復(fù)因UV照射導(dǎo)致的真皮層組織破碎、膠原纖維稀疏等，從而改善了膠原蛋白纖維基質(zhì)在皮膚的存在狀態(tài)。這一結(jié)果與皮膚中HYP含量上升(圖1-A)和MMPs含量下降(圖4)的變化相一致。因此，MLE可明顯地降低和修復(fù)UV照射引起的外在表皮層和內(nèi)在真皮層的光老化損傷，這與MLE中多酚物質(zhì)具有的抗氧化、抗炎和抑制MMPs產(chǎn)生等生物活性相關(guān)。

A-H&E染色；B-VG染色圖5 小鼠皮膚的組織形態(tài)和膠原結(jié)構(gòu)染色Fig.5 Tissue morphology and collagen structure staining of the mouse skin

3 結(jié)論

本文建立了UV照射小鼠皮膚光老化模型，評(píng)價(jià)MLE對(duì)光老化皮膚的保護(hù)作用。MLE可以有效地增加光老化皮膚的膠原蛋白和透明質(zhì)酸含量，提升抗氧化系統(tǒng)的活力、抑制MMPs含量的增加，修復(fù)皮膚表層和保護(hù)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。MLE對(duì)UV照射引起的皮膚光老化具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與MLE較好的體外抗氧化和抗炎活性相關(guān)。因此，MLE具有抑制皮膚光老化的潛在作用，在食品營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)學(xué)美容等領(lǐng)域具有一定應(yīng)用前景。