干酪乳桿菌細菌素的分離純化及抑菌特性分析

高兆建，曹珊珊，宋玉林，丁飛鴻，趙宜峰，焦魏

1(徐州工程學院，食品(生物)工程學院，江蘇 徐州，221018)2(長江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州，221000)3(邳州市金大地肥料有限公司，江蘇 徐州，221300)

PurificationofbacteriocinfromLactobacilluscaseiandanalysisofantibacterialcharacteristics

GAO Zhaojian1*,CAO Shanshan1,SONG Yulin1,DING Feihong1,ZHAO Yifeng2,JIAO Wei3

1(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221018, China)2(Yangtze River Guiliu Food Suining Co., Ltd., Xuzhou 221000, China)3(Pizhou Golden Earth Fertilizer Co., Ltd., Xuzhou 221300, China)

ABSTRACTThe aim of this work was to purify and characterize the bacteriocin (named as BaC21)produced byLactobacilluscaseiXbC-36 and laid a theoretical foundation for the further development of BaC21 as a new food preservative. BaC21 was purified by ammonium sulphate precipitation, Sephadex G-15 column chromatography and reverse-phase high-performance liquid chromatography. Molecular weight of BaC21 was determined by tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE). Production of bacteriocin BaC21 in MRS medium reached the maximum yield of 1 695 AU/mL at the beginning of the stationary phase (18 h). The molecular weight of BaC21 was 4.4 kDa. Because its molecular mass was not similar to other known bacteriocins, BaC21 could be a novel bacteriocin. Then, the antimicrobial activity of BaC21 was nearly not affected by heating at 37-100 ℃ for up to 30 min and decreased but not fully suppressed when exposed to a temperature of 120 ℃ for 15 min, indicating high thermal stability of BaC21. BaC21 remained stable at pH values ranging from 2 to 8. Antimicrobial activity was also not affected by organic solvents and surfactants. And, SDS improved its antibacterial activity. BaC21 was of proteinaceous nature, in which complete inactivation of its antimicrobial activity was observed after being treated with proteases, while lipase and α-amylase exhibited no effect. In addition, BaC21 had broad antimicrobial spectra and especially for Gram-negative food-borne pathogens. It revealed a bacteriostatic mode of action againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliin culture media. In conclusion, bacteriocin BaC21 shows great potential as a food bio-preservative.

KeywordsLactobacilluscasei; bacteriocin; separation and purification; antibacterial characteristics

近年來，全球消費者對安全天然食品重視程度日益增長，人們越來越追求健康的生活方式，對食品加工有了更高的要求，如食品加工過程簡單、維生素含量豐富、對健康有益、方便食用、感官特性保持完好、貨架期保存優良等。滿足這些期望是當前食品工業面臨的重大挑戰。伴隨著消費者對食品的生物保藏需求不斷增長，各種化學防腐劑、添加劑、抗生素等安全性問題得到普遍關注[1]。生物防腐劑除了減少因食物變質而造成的經濟損失外，還有助于保存食物的天然味道。因此，研究和開發安全高效的生物抑菌劑至關重要。乳酸菌是一群能利用碳水化合物生成乳酸的微生物，在自然界分布廣泛，是公認的食品級安全微生物，并且在醫藥及食品等領域具有極高的應用價值。

乳酸菌在糖發酵過程中產生各種各樣的天然代謝物，如乳酸、雙乙酰、過氧化氫和細菌素，同時賦予發酵食品獨特的風味、質地和香氣。細菌素是由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抗菌生物活性的蛋白質或多肽[2]，能夠抑制多種病原菌和腐敗菌，而產生菌對其有自身免疫性[3-4]。細菌素多數由革蘭氏陽性(Gram-positive，G+)菌產生，并且可以抑制其他親緣關系較近的菌株，而對大多數革蘭氏陰性(Gram-negative，G-)菌、真菌等均沒有抑制作用，如乳酸鏈球菌素。由于細菌素無毒、無殘留、無抗藥性，可以作為一種生物防腐劑廣泛應用于食品工業[1]，近年來不同來源的新型細菌素受到科研工作者的廣泛關注，眾多新型細菌素被陸續報道，如HU等[5]從發酵肉中分離的LactobacillusalimentariusFM-MM4細菌素對細菌及酵母菌有廣譜抗菌活性；周佳[6]所研究的腸球菌素SAU-2有良好的耐熱性與酸堿性，并且對G+菌有明顯抑菌作用，但對G-菌和真菌基本無抑菌活性；還有ZACHAROF等[4]對乳酸菌素的研究，COTTER等[7]對細菌素免疫的研究。乳酸鏈球菌素(nisin)是目前已經商業化生產應用的細菌素，對G+細菌有良好的抑菌效果，但它對G-菌、酵母和霉菌無抑菌效果，在中性pH環境下穩定較低，因此僅限于酸性食品使用[8]。盡管近年來不同特性的細菌素有大量報道，但在抑菌譜、穩定性、產量、抑菌活力及適用范圍等方面還存在眾多缺陷，故繼續開發新的細菌素資源，深入研究其特性仍十分必要。

本研究以實驗室分離的干酪乳桿菌XbC-36為菌種，從其發酵液中分離純化細菌素，并對其生長動力學、抑菌譜、相對分子質量、抑菌活性以及穩定性等方面分析，為該細菌素在天然食品防腐劑開發方面奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用產細菌素菌株干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)XbC-36分離自山東臨沂農村自然發酵豆制品，并通過菌體菌落形態、生理生化特征及16s rDNA序列分析鑒定，保藏于徐州工程學院食品與生物工程中心。

1.1.2 試劑及培養基

試劑：柱層析填充材料Sephadex G-15，美國Pharmacia公司；胰化蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid公司；蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

培養基：MRS培養基、營養瓊脂(nutrient agar，NA)培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基均由實驗室配制而成，各菌株所用培養基及培養溫度如表1所示。

1.1.3 儀器與設備

Sigma3k15冷凍離心機，德國SIGMA公司；UV-2450紫外可見光分光光度計，日本島津公司；DYY-6B凝膠水平電泳儀，北京市六一儀器廠；AKTAprime蛋白純化系統，美國GE Healthcare公司；Agilent 1260半制備高效液相色譜儀、Zorbax SB-C18高效液相色譜半制備柱，美國安捷倫公司；CascadaTM AN超純水系統，美國PALL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體生長動力學及細菌素合成

將活化后的菌株XbC-36按照接種量1%接種到MRS液體培養基(pH 6.5)，培養溫度32 ℃，培養時間48 h，每隔3 h取樣測定其吸光度及抑菌活性。

通過瓊脂孔擴散法測定抑菌活性，具體測定參照文獻[9-11]并稍作修改。制備對應不同指示菌的瓊脂培養基平板，指示菌調整到2.0×106CFU/mL并在平板上涂布150 μL，晾干后打孔。100 μL發酵液的上清液注入孔中，最適溫度下培養1～5 d，測定抑菌圈直徑大小。抑菌活力單位的定義為以S.aureus為指示菌，樣品經最大稀釋后，打孔檢測仍產生清晰抑菌圈的最大稀釋倍數的倒數作為1個抑菌活力單位。

1.2.2 細菌素的純化

BaC21的發酵制備：MRS瓊脂平板活化2次的L.caseiXbC-36接種于MRS液體培養基，32 ℃培養16 h后，取5 mL 菌液接種于495 mL MRS液體培養基中。在32 ℃下培養18 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液并經濾膜過濾后于80 ℃加熱15 min，調節pH 7.0，得到去細胞發酵上清液(cell-free fermentation supernatant，CFS)，于4 ℃冰箱短時保存備用。

分子篩凝膠過濾層析：以0.02 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液充分平衡層析柱(80 cm×1.5 cm)。經(NH4)2SO4鹽析、透析并超濾濃縮后的樣品上樣，相同緩沖液洗脫，流速0.8 mL/min。收集各洗脫峰，測抑菌活性，合并有活性收集管，超濾濃縮后備用。

半制備反向高效液相色譜(reverse-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)純化BaC21： RP-HPLC線性梯度洗脫，1 mL/min洗脫速度，溶劑A：體積分數5%乙腈中含有體積分數0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)，溶劑B：體積分數100%乙腈中含有體積分數0.1% TFA，52 min內溶劑A從體積分數85%到體積分數30%，溶劑B從體積分數15%到體積分數70%。手動收集洗脫峰，真空濃縮器中徹底去除乙腈，抑菌活性檢測，活性組分合并、凍干并進一步分析。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE測定BaC21分子質量

純化的BaC21 Tricine-SDS-PAGE測定純化程度及分子質量。電泳結束后凝膠的一部分用考馬斯亮藍染色，另一半無菌蒸餾水中洗滌3 h，置于培養皿中，LB(luria-bertani)培養基覆蓋，涂布S.aureus并37 ℃培養16～18 h，與染色脫色后的蛋白凝膠比較，觀察抑菌條帶。

1.2.4 酶、有機溶劑、化學試劑、pH和溫度對細菌素的影響

用胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶和α-淀粉酶做酶解實驗。調節部分純化的BaC21至酶最適pH，加入終質量濃度2 mg/mL的酶，37 ℃水浴2 h，80 ℃加熱15 min滅酶，檢測抑菌活性。

分別向部分純化的BaC21中添加體積分數1%的乙醇、異丙醇、丙酮、乙腈，1 g/L的Tween-80、Tween-20、Triton X-100和SDS， 37 ℃處理2 h后測定抑菌活性。

將部分純化的BaC21的pH調至2～9，37 ℃下處理2 h，測定其抑菌活性。

將部分純化的BaC21取5 mL分別置于37、60、80、100 ℃保溫30 min，121 ℃處理15 min，待溫度恢復到室溫測定抑菌活性。

以上活性檢測均以S.aureus為指示菌采用瓊脂孔擴散法測定?？瞻讓φ站且晕唇涍^任何處理的BaC21為樣品。

1.2.5 細菌素對S.aureus和E.coli的抑菌作用

將S.aureus和E.coli在37 ℃下培養至指數期中期(4 h)，按照兩指示菌100 mL培養液加入20 mLL.caseiXbC-36 CFS，并繼續培養，每隔2 h測定600 nm處的吸光度。對照組為未加入CFS正常培養的菌體。

1.2.6 數據統計與分析方法

數據統計分析參照陳文瑩等[12]報道的方法，檢測實驗均重復3次，結果以平均值±標準差(SD)表示。對實驗數據進行方差分析(ANOVA)，采用SNK方法評價差異顯著的結果進行兩兩比較，P<0.05認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 干酪乳桿菌XbC-36生長及細菌素合成

L.caseiXbC-36生長曲線及BaC21合成情況如圖1所示，接種6 h后開始合成BaC21(126 AU/mL)，在發酵6～18 h，BaC21的產量與吸光值成正比，抑菌活性顯著增加(P<0.05)，在穩定期初始階段菌體濃度最大時(OD600=2.156)合成最大量BaC21(1 695 AU/mL)。而在18 h后可能由于酸性抑制、菌體分泌蛋白酶的降解等因素導致BaC21活性略有下降[13]，但在36～48 h，抑菌活性變化不明顯(P>0.05)，而菌體吸光值基本保持不變(P>0.05)。不同來源細菌素達到最大產量的時間差異較大，如YI等[14]研究的Lactobacilluscrustorum細菌素60 h最大，WORAPRAYOTE等[15]報道的Weissellahellenica發酵12 h最大，PERUMAL等[16]報道的Enterococcusfaecalis細菌素發酵20 h產量最高。BaC21在指數期開始合成，隨著菌體生長BaC21產量增大并在穩定期達到最高，因此BaC21屬于初級代謝產物，這與MIRANDA等[17]、MARTINEZL等[18]研究的細菌素一致，但從細菌素發酵產量看L.caseiXbC-36所產細菌素更占優勢。

圖1 L. casei XbC-36生長動力學及BaC21合成Fig.1 Growth kinetics and bacteriocin biosynthesis of L. casei XbC-36注：未標注小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.2 細菌素的純化

分子篩凝膠柱層析結果如圖2所示，經層析得到5個明顯分離的洗脫峰。抑菌活性檢測顯示P3蛋白質峰出現抑菌圈，收集P3峰樣品進一步純化。

RP-HPLC如圖3所示，0～52 min很多不同種類的物質被洗脫出，表明經分子篩凝膠柱的樣品含有較多雜質且經RP-HPLC分離明顯，36 min后無洗脫峰出現，說明已經洗脫充分。手動收集11個峰的樣品檢測抑菌活性，保留時間19 min的洗脫產物即4號峰有抑菌活性。RP-HPLC是純化細菌素的高效方法，據報道陳一然[19]、PIARD等[20]、方佳琪[21]也采用該方法純化到了細菌素。

2.3 細菌素的分子質量及原位活性檢測

Tricine-SDS-PAGE如圖4所示，RP-HPLC得到的活性樣品1.2～4.6 kDa顯示1條清晰條帶，說明凝膠過濾層析和RP-HPLC可以有效純化BaC21，根據標準蛋白marker遷移率計算得到樣品分子質量4.4 kDa。凝膠原位抑菌實驗顯示，條帶對應位置產生明顯的抑菌條帶。由此可確定，考馬斯亮藍染色顯示的電泳條帶為有抑菌活性的目的產物，其分子質量在報道的絕大多數細菌素分子質量范圍內。據報道，不同微生物所產細菌素分子質量通常存在差異，BaC21分子質量與KAKTCHAM等[22]研究的乳鏈球菌素2MT分子質量相近(4.1 kDa)，但比來源于XI等[23]研究的糞腸球菌TG2(6.3 kDa)、AYED等[24]研究的芽孢桿菌(11 kDa)、GOH等[25]研究的腸球菌C1(10 kDa)的細菌素要??；比趙圣明等[26]報道的植物乳桿菌細菌素(0.9 kDa)分子質量要大。由此推測，BaC21可能是一種新型細菌素。

圖2 Sephadex G-15凝膠層析及BaC21抑菌檢測Fig.2 Sephadex G-15 gel chromatography and bacteriostatic experiments of BaC21

圖3 RP-HPLC純化L. casei XbC-36 BaC21Fig.3 Purification of BaC21 from L. casei XbC-36 by RP-HPLC

M-標準分子質量蛋白；1-純化后樣品；2-凝膠原位抑菌檢測圖4 Tricine-SDS-PAGE分析及抑菌活性檢測Fig.4 Tricine-SDS-PAGE analysis and bacteriostatic activity detection

2.4 細菌素的抗菌譜

BaC21抑菌情況如表1所示。BaC21對G+菌有較弱的抑菌活性，而對S.aureus抑制作用非常強，但對乳酸乳球菌無抑制作用。對大部分G-菌有強的抑制活性，但對于霍亂弧菌的抑制活性相對較弱，對真菌則無抑菌活性。整體看，BaC21對G-菌具有很強的抑菌作用，對G+菌稍弱。通常，因G-菌細胞壁中缺乏脂壁酸故細菌素不能抑制G-菌[13]，例如已經商業化的食品防腐劑nisin僅對G+菌有抗菌活性[27]，董雨馨等[28]研究的瑞士乳桿菌M14-1所產細菌素只對單核細胞增生李斯特氏菌有良好的抑菌效果，BENBRAEK等[29]研究的乳糖腸球菌4CP3只對真菌和G+菌有較強的抑制，楊亞晉等[30]研究的乳酸菌素BSN4和BCN4對G-菌和真菌都無明顯抑制效果。食品防腐中通常幾種不同的防腐劑聯合使用從而達到滿意的抑菌效果。BaC21可以作為一種天然的生物防腐劑和nisin等細菌素聯合使用，發揮互補抗菌效果。

表1 BaC21對各指示菌抑制作用Table 1 The antibacterial spectrum of bacteriocin against various indicator strains

2.5 酶及物理化學處理對細菌素抗菌活性影響

酶及各物理化學因素處理結果如表2所示。在不同蛋白酶處理后，BaC21抗菌活性完全喪失，同對照相比差異顯著(P<0.05)，脂肪酶和α-淀粉酶處理后抑菌活性無顯著變化(P>0.05)。表明菌株XbC-36所產抗菌物質具有蛋白質特性。另一類重要的天然抗菌物質是主要來源于芽孢桿菌的脂肽，因結構中存在非正常氨基酸構成的環狀肽鏈而對各種蛋白酶不敏感。BaC21經所試酶處理后的活性表現說明其分子中不存在脂肪、淀粉鏈，也不存在非正常的氨基酸鏈，這與所報道的其他細菌素一致，故可判斷菌株XbC-36所產抗菌物質同為細菌素。BaC21蛋白質性質意味著它在食品中可以作為天然防腐劑抑制食源性致病菌、腐敗菌的生長，當其同食品一起被食用后可在人胃腸道中降解并作為營養素被人吸收。

細菌素從發酵液中沉淀分離、高分子吸附介質層析、疏水層析及HPLC純化時經常用到不同有機溶劑沉淀或洗脫，有必要分析檢測其有機溶劑穩定性。用丙酮、乙腈、乙醇和異丙醇等有機溶劑對BaC21處理，其抗菌活性無明顯下降(P>0.05)。證實BaC21分子中不存在與抗菌活性有顯著影響的易溶于有機溶劑的脂質分子[31]，因此，BaC21可以應用于高脂肪食品的保鮮。

表面活性劑吐溫20、吐溫80、Triton 100對BaC21抗菌活性無顯著影響(P>0.05)；而SDS能夠增強抑菌活性，推測可能是SDS改變了細胞膜的通透性，與此相似的報道還有Lysinibacillussp. JX402121細菌素[32]、Lactococcuslactissubsp. lactis 2MT細菌素nisin[22]。

BaC21在pH 2～7時，穩定性最佳，抑菌活性基本無明顯變化(P>0.05)；在pH 9.0時，穩定性有所下降，但其抑菌活性仍保持60%以上，同對照差異顯著(P<0.05)。BaC21在酸性條件下表現出更佳的穩定性，這與報道的大部分細菌素相似，如HU等[5]從LactobacillusalimentariusFM-MM4分離的細菌素MM4在pH 7.0以上穩定性大幅降低；羅怡等[33]研究的乳酸菌素在堿性條件下完全失活；WAYAH等[1]研究的LactobacillussalivariusSPW1細菌素在pH 8.0以上穩定性變差。在強堿性條件下的不穩定性可能是因為極端的堿性pH條件下，分子間強靜電作用導致多肽氨基和羧基解離，最終導致蛋白質變性抑菌活性喪失[27]。

BaC21在100 ℃以下30 min內活性基本無變化(P>0.05)，但當超過100 ℃之后穩定性下降，特別是在121 ℃、15 min穩定性下降明顯(P<0.05)，其抑菌活性保留55.2%。整體說明BaC21具有優良的熱穩定性。在食品中使用時可以耐受食品加工工藝的熱處理過程。

表2 細菌素BaC21穩定性分析Table 2 Stability analysis of bacteriocin BaC21

2.6 細菌素對S. aureus和E. coli的抑菌模式

BaC21對E.coli和S.aureus的抑菌情況如圖5所示，在不添加BaC21情況下，兩指示菌株呈現典型的細菌生長特征，2 h前為延遲期，2～8 h呈指數生長，8～24 h逐漸從指數期過渡到穩定期。而當在培養4 h加入BaC21后，兩指示菌生長顯示立即受到抑制，吸光度逐漸降低，培養24 h兩者OD值分別為0.301及0.101。由此可知BaC21對S.aureus和E.coli不僅具有明顯的抑制作用同時還可使細胞裂解。

圖5 BaC21對S. aureus和E. coli生長的影響Fig.5 Effect of bacteriocin on the growth of S.aureus and E.coli注：小寫字母表示同對照組間顯著差異(P<0.05)

3 結論

從L.caseiXbC-36發酵液中通過兩步純化即分子篩凝膠過濾層析和RP-HPLC純化到單一組分的BaC21，其分子質量與報道的其他細菌素不同。BaC21在酸性、中性及弱堿性環境下有良好的穩定性，并可耐受100 ℃的熱處理，對有機溶劑、表面活性劑耐受性好。對G+菌和G-菌都有廣譜抑菌活性，特別是對G-菌如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、腸沙門氏菌、副溶血性弧菌等表現出更為顯著的抑菌活性。經多種蛋白酶處理后完全失活，但對脂肪酶和淀粉酶不敏感。S.aureus和E.coli在培養中添加BaC21，菌體生長受到完全抑制。綜上結果表明，BaC21有潛力用做天然食品防腐劑，可以和nisin等抗菌劑聯合使用提高食品的質量和安全。