一株庫車小白杏采后軟腐病原細菌的分離鑒定及驗證

劉曉靜，楚敏，朱靜，唐琦勇，宋素琴，孫建，朱璇，張志東*

1(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830091)2(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)

杏為薔薇科杏屬，起源于我國新疆[1]。新疆阿克蘇庫車縣素有“中國杏鄉”之稱，其中，庫車小白杏是地理標識產品之一。杏果含有豐富的維生素、糖類、檸檬酸、蘋果酸等營養成分，性味甘酸、微溫，故具有生津止渴，清熱解毒的特點，有一定的保健和防癌作用，深受廣大群眾的喜愛[2]。然而，由于庫車小白杏為典型的呼吸躍變型果實，且鮮果成熟期較為集中，采后易腐敗變質，嚴重制約了其生產、銷售和新疆特色林果業的發展[3-4]。一般認為，杏果的軟腐變質除了與其生理生化過程相關外，主要由病原真菌引起，與其大量繁殖有關[5]。目前，杏果的相關研究主要集中在貯藏保鮮[6-7]和真菌侵染防治[8-9]等方面，常采用氣調貯藏、低溫貯藏、冰溫貯藏、涂膜保鮮、化學保鮮劑處理等方法，以降低杏果的生理活性和抑制病原菌的生長[10]，鮮有杏果采后細菌性病害的報道，暫未見庫車小白杏病原細菌的相關研究。

本研究以采后自然軟腐變質的庫車小白杏為對象，通過傳統可培養法對其潛在病原細菌進行分離、篩選，并對其16S rDNA序列和生理生化特性進行了分析。同時，驗證并分析了主要潛在病原細菌的致病能力和藥敏特性，為庫車小白杏采后貯藏保鮮、軟腐及病害的防治等相關研究提供了基礎，為進一步從微生物角度闡明庫車小白杏采后軟腐變質的內在機理提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

庫車小白杏，2019年6月采自新疆阿克蘇市庫車縣烏恰鎮的4個果園中。采用隨機法采樣，并根據轉黃率將果實分為青熟期(著色面積<20%)、轉色期(著色面積40%～60%)和完熟期(著色面積>80%)3種不同成熟度[1]，選擇果實自然成熟，無機械傷痕，無病變，且表皮有光澤，顏色、大小、硬度等表觀一致的小白杏(2.0～2.5) cm×(2.5～3.0) cm，經發泡網包裹裝筐后，12 h內運回實驗研究室，2 ℃下進行貯藏試驗。試驗組于室溫下貯藏，用于軟腐病原細菌的分離。

藥敏紙片(青霉素 10 IU/片、萬古霉素 30 μg/片、環丙沙星5 μg/片、克林霉素15 μg/片、紅霉素15 μg/片、氨芐西林10 μg/片、磺胺甲惡唑23.75 μg/片、氯霉素30 μg/片、利福平5 μg/片、鏈霉素10 μg/片、慶大霉素10 μg/片、阿米卡星30 μg/片、四環素30 μg/片、妥布霉素10 μg/片、卡那霉素30 μg/片、諾氟沙星10 μg/片)，北京天壇生物制品股份有限公司。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextros agar，PDA)：200 g馬鈴薯去皮切塊后熱水煮25～35 min，過濾后加入葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，調節pH 7.0。

38號培養基：葡萄糖4 g，麥芽浸粉3 g，酵母粉4 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，調節pH 7.2。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離與純化

小白杏樣品置于自來水下沖洗干凈，經酒精棉擦拭后，晾干，無菌條件下去皮，利用平板劃線法、稀釋涂布法(切取病健交界處組織10 g加入至90 mL滅菌的8.5 g/L生理鹽水中，勻漿，并將組織懸液稀釋，按10-1、10-2梯度稀釋至10-3，取0.1 mL組織懸液均勻涂布于PDA和38號培養基上)，對自然軟腐杏果中的主要病原細菌進行分離、篩選。同時，設置3個重復，于28 ℃條件下進行培養，每間隔24 h觀察其變化情況。

待菌落長出，根據菌落的形態、大小及顏色進行初步篩選，將不同形態的單菌落劃線接種于新培養基上，再次進行培養，不斷重復此操作，直至得到形態單一的菌落為止。純化后的菌株接種至PDA培養基斜面上，于4 ℃下保存備用[11]。

1.3.2 菌株的分子鑒定

采用菌落克隆方法，利用細菌16S rDNA序列通用引物27 F和1492 R進行PCR擴增[12]。條件為95 ℃、5 min；95 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、2 min，30個循環；72 ℃、10 min。PCR產物經切膠純化回收后，送往北京鼎國生物技術有限公司進行測序。

所測得的序列經人工校正后，上傳EzTaxon 數據庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/ identify)進行比對，并調取相關模式菌株序列，使用MEGA 5.0進行Clustal X多重比對，并使用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，自舉值為1 000，初步確定菌株的生物學分類地位[13-14]。

1.3.3 菌株生理生化鑒定

革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶、水解淀粉、D-葡萄糖產酸、利用甘油產生二羥基丙酮等生理生化反應參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》《常見細菌系統鑒定手冊》，唯一碳源利用采用Biolog GNII板，并參照說明書進行操作[15-17]。

1.3.4 菌株致腐能力驗證

青熟期、轉色期、完熟期的庫車小白杏(5個為1組)于無菌條件下，采用離體接種法對菌株的致病能力進行測定。使用酒精棉對庫車小白杏進行表面消毒后，無菌水沖洗，晾干，用0.1 mL無菌針頭從PDA平皿培養的新鮮菌落中挑取小量菌苔，將其穿刺接種于果肉中(接種深度距表皮2 mm)，采用保鮮膜包裹傷口處，于室溫25 ℃下進行貯藏。同時，分別設置未接種的自然對照組和接種無菌水的實驗陰性對照組，以上實驗組均設置3個重復。觀察并記錄庫車小白杏的發病情況[18]。

1.3.5 致腐菌的再分離和比較

酒精棉對接種組中發生軟腐杏果的表皮進行擦拭消毒，無菌條件下去皮，并采用劃線培養法、稀釋涂布法對病灶組織中的微生物進行分離、純化及鑒定，并與接種菌株進行比較。

1.3.6 藥物敏感試驗

采用紙片擴散法[19]，無菌條件下，取0.1 mL菌懸液涂布于培養基上，在距培養基中心2.5 cm處的4個垂直點分別放置藥敏試紙，每個處理作3個平行和1個空白對照，于28 ℃下培養3～7 d，觀察菌株XAAS-XY2與各藥敏試紙之間是否存在透明抑菌圈，存在透明抑菌圈則為陽性，并測量透明抑菌圈直徑，用以判斷菌株對各類藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 杏果采后后熟與腐敗過程

由于庫車小白杏采后存在后熟過程，較難貯藏。因而長途運輸小白杏時，通常選擇表皮黃色面積為20%～40%的青熟期杏果進行采摘(圖1-a)，此時果實具有一定硬度，口感較酸略澀。而貨架期的杏果，一般于其轉色期進行采摘(圖1-b)，此時表皮黃色面積為40%～60%，果實硬度略微下降，口感酸甜，自然放置約3 d后進入完熟期(圖1-c)，表皮黃色面積>90%，果實硬度降低，開始出現軟化，口感香甜無酸澀；繼續放置1～2 d后，表皮完全變黃，果肉完全軟化，并呈現半透明狀態，具有一定流動性和較高的甜度。

a-青熟期;b-轉色期;c-完熟期圖1 不同成熟度的庫車小白杏Fig.1 Kuqa apricot with different maturity stages

庫車小白杏極易在采摘、運輸及貯藏等過程中發生機械損傷，導致杏果快速軟腐變質。以青熟期的庫車小白杏為例，室溫條件下，采后第3～4天機械損傷部位開始出現淺棕色、輕微的水漬狀斑點，1～2 d后，水漬狀斑點迅速擴展(圖2-a)；繼續放置1 d后，病斑擴展至全果且顏色顯著加深，由淺棕色逐漸變成深褐色(圖2-b、圖2-c)；繼而杏果嚴重失水，并伴隨嚴重的真菌侵染現象(圖2-d)。

a-第4～6天；b～c-第5～7天;d-第8天圖2 不同腐敗變質程度的庫車小白杏Fig.2 Kuqa apricot with different degree of decay

2.2 菌種篩選與鑒定

通過對軟腐小白杏中潛在致病菌的分離、純化、去重，實驗獲得了1株菌落較小(直徑為1.0～1.5 mm)、圓形、略隆起、邊緣整齊、黏稠、白色(圖3-a所示)的細菌，命名為XAAS-XY2。該菌株為革蘭陰性菌、桿狀(圖3-b)。經 PCR 擴增和16S rDNA序列測定及比對，并構建該菌株系統發育進化樹(圖4)，確定菌株XAAS-XY2歸屬于葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，其與已知模式菌株GluconobacterfrateuriiNBRC 3264T和GluconobacterjaponicusNBRC 3271T序列相似性均為99.93%，與GluconobacterthailandicusF149-1T序列相似性為99.77%，暫不能確定其具體分類。

a-菌落形態;b-菌體顯微形態圖3 菌株XAAS-XY2的形態特征Fig.3 Morphological characteristics of strain XAAS-XY2

2.3 生理生化分析

對菌株XAAS-XY2生理生化特性進行分析，結果表明，氧化酶、水解淀粉、液化明膠、D-木糖產酸、麥芽糖產酸均呈陰性；接觸酶、D-葡萄糖產酸利用甘油產生二羥基丙酮呈陽性；可利用阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖為其生長提供能量。其與GluconobacterfrateuriiATCC 49207T和GluconobacterjaponicusNBRC 3271T均存在一定差異(表1)，具體分類學地位仍有待進一步系統分類。因此，該菌暫定名Gluconobactersp. XAAS-XY2。

圖4 菌株XAAS-XY2 16S rDNA序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XAAS-XY2 based on 16S rDNA sequences

表1 菌株XAAS-XY2生理生化鑒定指標Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain XAAS-XY2

2.4 致病能力分析

實驗利用離體接種法，驗證了菌株XAAS-XY2對采后青熟期、轉色期、完熟期庫車小白杏的致腐效果。結果表明，菌株XAAS-XY2對采后不同成熟度的庫車小白杏均表現出了較強的致腐能力(圖5、圖6)，但對完熟期的致腐能力最強，接種48 h時，致腐率為60%；接種96 h時，致腐率達100%。其次為轉色期，接種48 h時，致腐率為40%；接種96 h時，致腐率達100%。其對青熟期的致病能力最弱，接種48 h 時，致腐率為20%；接種96 h時，致腐率達100%。而在自然對照組中，完熟期雖最快出現軟腐癥狀，但與以上接種組相比，其在相同條件下放置48 h時，未出現任何病斑及軟腐癥狀；放置96 h時，僅個別杏果出現輕微的淺棕色病斑，軟腐率約為26.67%，由此可見，接種菌株XAAS-XY2的小白杏提前2 d出現了明顯的軟腐現象，且致腐率高達100%(圖7)。

圖5 在不同成熟期杏果上接種XAAS-XY2的致腐情況Fig.5 Decay ratio of Kuqa apricot in different maturity stages strain XAAS-XY2

a-青熟；b-轉色；c-完熟圖6 接種XAAS-XY2 96 h時不同時期小白杏軟腐發病特征Fig.6 Decay character of Kuqa apricots in different matturity stage inoculated XAAS-XY2 after 96 h

圖7 不同處理144 h時不同時期小白杏軟腐發病特征Fig.7 Decay of Kuqa apricot with treatments after 144 h in different maturity stages

2.5 主要軟腐菌的分析

為進一步證實菌株XAAS-XY2是引發小白杏采后軟腐變質的主要病原細菌，實驗分別對接種組中出現軟腐的果肉、另一側未接種但出現軟腐的果肉、自然對照組中出現軟腐的果肉，進行了主要微生物的分離、純化與鑒定。結果如表2所示，菌株XAAS-XY2大量分布于上述3組樣品中，且均為絕對優勢菌群(圖8)。

綜上所述，實驗證明了菌株XAAS-XY2是導致庫車小白杏采后軟腐變質的主要病原細菌。

表2 菌株XAAS-XY2分子鑒定Table 2 Molecular identification of strain XAAS-XY2

圖8 接種組病灶組織劃線菌落形態Fig.8 Colony morphology of bacteria from decay focus by streaking on PDA

2.6 藥物敏感試驗的分析

實驗測試了常用細菌抗生素對菌株XAAS-XY2的抑制作用，結果如表3所示。卡那霉素、四環素、妥布霉素、阿米卡星、鏈霉素、利福平、慶大霉素、諾氟沙星對菌株XAAS-XY2均表現出了較強的抑制作用。其中，卡那霉素、四環素、妥布霉素對其抑制作用最強(圖9)，抑菌直徑均>30 mm；阿米卡星次之，抑菌直徑約為23 mm；鏈霉素、利福平、慶大霉素、諾氟沙星對其抑制作用較弱，抑菌直徑均<20 mm。而青霉素、萬古霉素、環丙沙星、克林霉素、紅霉素、氨芐西林、磺胺甲惡唑、氯霉素對其未表現出明顯的抑制作用。

表3 常用抗生素對菌株XAAS-XY2的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of common antibiotics on XAAS-XY2

10-利福平；11-鏈霉素；12-慶大霉素；13-阿米卡星；14-四環素；15-妥布霉素；16-卡那霉素；17-諾氟沙星圖9 抗生素對菌株XAAS-XY2的抑制情況Fig.9 Inhibition of strain XAAS-XY2 by antibiotics

3 討論與結論

庫車小白杏為呼吸躍變型果實，極易軟腐變質。采后自然放置3～5 d后會出現淺棕色小斑點，后發展為深褐色病斑，中央稍凹陷，邊緣水漬狀，隨后迅速擴展，繼而全果軟化、腐爛，甚至霉變。一般認為，庫車小白杏的軟腐變質由真菌引起，國內先后分離出白曲霉(Aspergillusniger)、粉紅單端孢霉(Trichotheciumroseum)、鏈格孢霉(Alternariaalternata)和天門冬擬莖點霉(Phomopsisasparagi)等病原真菌[20-21]。本研究前期通過Biolog Eco生態板法結合高通量測序法，首次從內生細菌的角度揭示了庫車小白杏內生細菌群落結構隨著成熟度的增加，存在明顯的更替，主要菌群由蟑螂桿狀體科未分類屬演替為葡糖桿菌屬和泛菌屬，并成為絕對優勢菌群；其他非優勢菌群則顯著下降[22]。

葡糖桿菌存在于含糖豐富的環境中[23]，甚至出現在食醋[24]、酸奶[25]、紅酒[26]、果汁、酒精飲料中[27-28]，易導致植物、果實的腐爛，致使食醋返混，酸奶變色，紅酒、果汁變質。但對人畜無致病性。目前，少量研究表明，葡糖桿菌常大量附著于瓜果的表面或果實內部。如張大為等[29]率先發現葡糖桿菌屬、不動桿菌屬微生物在腐爛、霉變的柑橘中大量存在；譚才鄧等[30]從腐爛的水果中篩選出了醋酸高產菌-弗氏葡糖桿菌(Gluconobacterfrateurii)；朱藝恒等[31]發現自然腐敗的南豐蜜橘中也存在產醋酸的葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobactersp.)；姜蕾等[32]發現新疆釀酒葡萄表皮中白葡糖桿菌(Gluconobacteralbidus)為優勢菌屬。近些年，隨著高通量測序技術的快速發展，戴寶玲等[33]進一步證明了葡糖桿菌屬是草莓表面的主要微生物，并推測其可能是導致草莓污染的重要病原菌；張源等[34]對自然發酵草莓酒中的細菌群落進行研究發現，葡糖桿菌屬與檸檬酸菌屬在草莓酒的后期陳釀過程中可能發揮了重要作用。

本研究從采后軟腐變質的庫車小白杏中分離獲得了1株病原細菌XAAS-XY2，經鑒定確定其歸屬于葡糖桿菌屬。并將其分別接種于青熟期、轉色期、成熟期的庫車小白杏中，均出現了明顯的軟腐現象。其中，對完熟期的致病能力最強，接種96 h致腐率高達100%，且與自然對照組相比，接種組提前2 d出現了軟腐現象。同時，對接種組中軟腐組織的微生物進行了再分離，證明了軟腐杏果組織中的主要菌群為XAAS-XY2，進一步證實了XAAS-XY2是導致小白杏軟腐變質的主要病原細菌。

另外，本研究發現卡那霉素、四環素、妥布霉素、阿米卡星、鏈霉素、利福平、慶大霉素、諾氟沙星對菌株XAAS-XY2均表現出了較強的抑制作用。然而，由于果實采摘期和儲存期嚴禁相關化學藥物的使用，特別是抗生素的濫用，因而上述抗生素不宜在該時期使用。然而，植物內生菌的定殖和演變受多種因素的影響。如崔凱[35]發現農藥的使用能明顯影響和改變內生細菌組成。吡蟲啉、噻蟲嗪和苯醚甲環唑使根部群落豐富度降低；毒死蜱使水稻根內生及根圍土壤中細菌群落發生了變化，低濃度可使菌群多樣性提高，高濃度則會抑制。因此，選用對菌株XAAS-XY2有抑制作用的相應抗生素，選擇合適的小白杏樹生長周期，通過使用不同藥物或相關措施，改變內生菌的組成，阻斷葡糖桿菌屬病原細菌進入杏果實內，以減少其適應、定殖為內生菌的概率，為源頭控制小白杏采后軟腐的發生提供了新思路。