p300/CBP相關因子對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響及機制研究

徐昌武，邱立強，夏 豪，江 洪

心腦血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，嚴重威脅人類生命健康[1]。動脈粥樣硬化是冠心病和腦卒中等多種心腦血管疾病的病理基礎，而血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖在動脈粥樣硬化和血管狹窄中起著決定性的作用[2]。p300/CBP相關因子(PCAF)是一種轉錄輔激活子，具有組蛋白乙酰基轉移酶活性，最新研究顯示PCAF在腫瘤發生、增殖和侵襲、細胞周期調控、凋亡以及基因轉錄、DNA損傷后修復等細胞生命過程中發揮著重要作用[3-5]。但其在VSMCs中是否具有類似促進細胞增殖的作用卻鮮有報道。為此，本研究通過構建病毒以下調PCAF的表達，觀察其對大鼠胸主動脈平滑肌細胞增殖的作用以及對相關信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠(120～150 g)購自湖北省實驗動物研究中心。DMEM/F12培養基及1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，成分包括137 mmol/L氯化鈉、2.7 nmol/L氯化鉀和10 mmol/L PBS，pH 7.3～7.5，均購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；Ad-GFP、Ad-PCAF RNAi(含GFP)重組腺病毒購自上海吉凱基因有限公司；CCK-8細胞毒性及增殖檢測試劑盒(CCK-8)購自日本株式會社同仁化學研究所；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、VSMCs表型標志蛋白(α-SM-actin)抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自碧云天生物技術研究所；絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)一抗均購自美國CST公司；羊抗兔熒光二抗購自美國LI-COR 公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國merck-millipore公司；脫脂奶粉購自武漢谷歌生物科技有限公司；Trizol購自南京AIDLAB公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細胞的分離培養和鑒定 參照文獻[6]，采用組織塊貼壁法培養大鼠胸主動脈VSMCs，用大鼠α-SM-actin抗體進行免疫熒光染色鑒定VSMCs。結果顯示，α-SM-actin陽性顯色率達到95%以上。第3代～第5代細胞用于后續實驗。

1.2.2 病毒轉染 將VSMCs以2×105個/孔種植于六孔板中，待細胞生長覆蓋至孔底壁約60%左右時，棄去培養液，然后用PBS清洗細胞3次，按照感染復數(MOI)為50加入病毒，進行轉染細胞4 h，然后棄去含有病毒的培養液，并加入含10%FBS的培養液繼續培養細胞。

1.2.3 實驗分組 對照組(A組)、對照組+1 μg/mL 脂多糖(LPS)刺激組(B組)、Ad-GFP腺病毒轉染組(C組)、Ad-GFP腺病毒轉染+1 μg/mL脂多糖刺激組(D組)、Ad-PCAF RNAi腺病毒轉染組(E組)、Ad-PCAF RNAi腺病毒轉染+1 μg/mL 脂多糖刺激組(F組)。

1.2.4 CCK-8實驗確定脂多糖使用濃度和檢測細胞增殖 ①脂多糖使用濃度的確定：將細胞以2.0×104個/孔的密度接種在96孔板中。待細胞融合至60%時，換無血清培養液饑餓處理24 h，再與不同劑量(0 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和50 μg/mL)的脂多糖共同孵育24 h，然后向每孔加入10 μL CCK-8試劑(使CCK-8試劑含量為10%)繼續培養2 h后，在酶標儀上(450 nm)測各孔的光密度(OD)值。每組設6個復孔。②細胞增殖檢測：將各組細胞按2.0×104個/孔分別接種于96孔板中，待細胞融合至50%～60%，換無血清培養液饑餓處理24 h后，將培養液更換為含1% FBS的培養液或含1% FBS+1 μg/mL脂多糖的培養液繼續培養，24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續培養2 h后，在酶標儀上(450 nm)測各孔的OD值。每組設6個復孔。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期 將細胞以2×105個/孔接種于6 cm培養皿中，待細胞融合至60%左右時，饑餓處理24 h。后將各組培養液更換為含1% FBS的培養液或含1% FBS+1 μg/mL 脂多糖的培養液，繼續培養24 h。接著用胰酶將細胞消化下來并離心，用PBS洗滌2次后加入預冷的70%乙醇固定細胞并4 ℃過夜。取出細胞離心并用PBS洗滌細胞2次，然后加入0.4 mL 碘化丙啶(PI)稀釋液(含50 mg/L的PI和100 mg/L的RNase A)室溫避光孵育30 min，然后使用流式細胞儀(Becton Dickinson，美國)檢測各組細胞周期分布情況，并計算出各組細胞處于G1期、S期、G2期的比例[7]。

1.2.6 實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測PCAF mRNA表達 采用Trizol提取細胞總RNA。用AMV反轉錄試劑盒(Promega公司)進行cDNA合成和擴增。相關基因的引物序列見表1。Q-PCR法檢測PCAF基因mRNA表達。

表1 Q-PCR檢測基因及引物序列

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達 蛋白抽提后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。按每孔30 μg總蛋白于預先配制好的10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行蛋白分離。然后電轉至預先活化好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。電轉完成后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST(1×PBS含0.1%吐溫-20)洗滌3次×5 min后，分別與兔抗大鼠α-SM-actin、p38 MAPK、p-p38 MAPK、AKT、p-AKT、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜用PBST洗滌3次×5 min，再與熒光標記羊抗兔二抗室溫孵育1 h。取出PVDF膜，在避光環境下用PBST洗滌3次×5 min后使用Odyssey雙色近紅外激光成像系統(Li-Cor Biosciences，美國)采集蛋白條帶圖像，測定灰度值通過校準GAPDH作為內參進行半定量分析。

2 結 果

2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細胞及病毒轉染效率的鑒定 VSMCs特異性的α-肌動蛋白進行免疫熒光染色結果顯示，α-SM-actin陽性顯色率達到95%以上(見圖1A)。細胞轉染病毒24 h后在熒光顯微鏡下拍得照片，轉染效率達90%以上(見圖1B)。符合實驗要求。

圖1 大鼠VSMCs及Ad-PCAF RNAi重組腺病毒轉染VSMCs效率的鑒定

2.2 脂多糖最佳使用濃度的確定 當脂多糖使用濃度為1 μg/mL時VSMCs增殖能力明顯提高，但隨著脂多糖濃度的進一步增加其增殖能力增速減慢，故在本實驗中選擇脂多糖濃度為1 μg/mL。詳見圖2。

與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.3 各組PCAF mRNA表達及VSMCs增殖活性比較 與A組比較，C組PCAF mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)；與C組比較，E組PCAF mRNA水平降低約87.8%(P<0.05)，VSMCs增殖活性明顯降低(P<0.05)。與B組比較，D組PCAF mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)；與D組比較，F組PCAF mRNA水平明顯下降近82.1%(P<0.05)，VSMCs增殖活性明顯降低(P<0.05)。另外，B組較A組、D組較C組、F組較E組，PCAF mRNA水平分別增加0.63倍、0.67倍和1.45倍，與此同時，VSMCs增殖活性分別提高11.5%、14.7%和10.5%，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組PCAF mRNA表達及VSMCs增殖活性比較(±s)

2.4 下調PCAF表達對VSMCs細胞周期的影響 與A組比較，C組細胞周期分布差異無統計學意義(P>0.05)；與C組比較，D組細胞經脂多糖刺激后S期(藍色斜線區域)細胞明顯減少，而G2期(黃色區域)細胞占比明顯增多(P<0.05)，提示脂多糖刺激后細胞由S期(藍色斜線區域)進入G2期(黃色區域)，細胞周期進展加快，細胞增殖能力增強。然而與D組比較，F組下調PCAF后，S期(藍色斜線區域)細胞明顯增多，G2期(黃色區域)細胞占比明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，細胞周期S期到G2期阻滯，細胞增殖能力減弱。詳見圖3。

與C組比較，*P<0.05，△P<0.01；與D組比較，#P<0.05。

2.5 下調PCAF抑制p-p38 MAPK及p-AKT表達 與A組比較，C組p-p38 MAPK及p-AKT表達差異均無統計學意義(P>0.05)；與C組比較，E組細胞中p-p38 MAPK及p-AKT表達明顯降低(P<0.05)；與D組比較，F組p-p38 MAPK及p-AKT表達明顯降低(P<0.05)；B組較A組、D組較C組、F組較E組，細胞中p-p38 MAPK及p-AKT表達升高(P<0.05)；另外，6組總的p38 MAPK和AKT表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖4。

與D組比較，*P<0.05，△ P<0.01；與E組比較，#P<0.05。圖4 Western Blot分析各組蛋白表達情況

3 討 論

VSMCs的過度增殖在血管成型術后再狹窄及動脈粥樣硬化的病理過程中起關鍵作用。血管損傷時，損傷血管周圍內皮細胞及炎性細胞等分泌細胞因子和生長因子等介質，引起損傷部位的VSMCs由靜止的“收縮型”向活躍的“合成型”轉變，導致VSMCs從中膜向內膜大量增殖和遷移，同時合成細胞外基質參與血管修復，從而形成新生內膜過度增生[8]。因此，有效抑制血管損傷后平滑肌細胞的過度增殖，在抗血管再狹窄和抗動脈粥樣硬化治療中具有重要意義。

PCAF即p300/CBP 相關因子，它是一種轉錄輔激活因子且具有組蛋白乙酰基轉移酶活性，可通過乙酰化組蛋白和非組蛋白的方式參與基因的轉錄調控，與細胞分化、凋亡、腫瘤發生等密切相關[9]。國內外研究發現PCAF在促進腫瘤細胞增殖和遷移中具有重要作用，而關于PCAF在血管增生相關疾病中的研究較少。最新實驗研究發現，在小鼠股動脈損傷模型中，PCAF基因敲除的小鼠損傷部位血管內膜增生程度明顯較野生型減輕[10]。這與本研究結果相符，本研究通過體外培養VSMCs發現，下調VSMCs內PCAF基因的表達后，VSMCs增殖能力明顯降低。因此，PCAF作為一種具有組蛋白乙酰轉移酶活性的轉錄輔激活因子，在與VSMCs增生相關的疾病如血管再狹窄和動脈粥樣硬化的病程中發揮著重要的作用。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和p38 MAPK途徑是關鍵的細胞內信號傳導途徑，參與多種生理和病理過程，如細胞增殖、細胞周期及炎性反應[11-14]。在多項關于VSMCs增殖的研究中發現，抑制AKT以及p38 MAPK等的磷酸化可以抑制VSMCs增殖[15]。因此，本研究進一步檢測了PI3K/AKT和p38 MAPK信號通路的活性，發現下調PCAF的表達后，VSMCs內AKT和p38 MAPK的磷酸化水平也隨之降低。這些結果提示，下調PCAF表達所導致的VSMCs增殖能力下降，與抑制AKT和p38 MAPK磷酸化有關。

總之，本研究結果表明，PCAF在VSMCs增殖中具有重要的作用。下調PCAF的表達，可明顯抑制VSMCs增殖，而發揮作用的機制至少部分與下調PCAF表達后，VSMCs內AKT及p38 MAPK磷酸化受阻有關。由此推測PCAF可能是較為理想的治療血管成形術后再狹窄及動脈粥樣硬化的一個潛在靶點。