長春西汀對慢性腦缺血大鼠神經功能保護機制的研究

王 剛，仲婷婷，蔣 毅，陳璽龍，王小琴，王慧云

慢性腦缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是指由各種病因誘發的腦血流長期灌注不足，在多種神經系統疾病病程中起關鍵作用[1]。慢性腦缺血的早期臨床表現主要為記憶下降及逐漸進展的認知和運動障礙，病理損傷機制及神經保護機制復雜，目前尚未完全明確，嚴重影響病人及家屬的日常工作及生活[2]。據統計，慢性腦缺血發病率在我國呈現逐年增高趨勢，其原因與現代人群飲食方式改變及老齡化進程加劇有關[3]。因此，對慢性腦缺血發病機制及治療方案的研究，已成為臨床亟待解決的問題。臨床對慢性腦缺血發病機制的研究主要集中在神經遞質功能紊亂、氧化應激、細胞凋亡、突觸異常、炎癥損傷、能量代謝障礙等方面[4]；對其神經功能保護方面，研究主要集中在是神經再生、神經再生障礙、神經營養因子和抑制性因子等方面，雖已取得了可喜的成果，但仍存在部分不足[4]。有研究表明，長春西汀有明顯的“益智作用”，并對腦缺血后神經功能具有一定的保護作用[5]。本研究觀察長春西汀對慢性腦缺血大鼠的神經保護機制，為臨床治療慢性腦缺血提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康成年Wistar 大鼠30只，雄性，鼠齡 3～4 個月，體重(270±30)g，動物領取后置于潔凈飼養籠中飼養1周開始進行實驗，飼養濕度 70%，溫度(22±3) ℃，自由飲水，晝夜正常交替。

1.2 試劑與儀器 長春西汀注射液[商品名：潤坦，河南潤弘制藥股份有限公司生產，國藥準字H20041792，規格：每支2 mL(20 mg)]；Nogo-A一抗、OMgp一抗及MAG一抗均購自北京博奧森生物工程有限公司；兔抗大鼠白細胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)抗體、兔抗大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 抗體、兔抗小鼠白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)抗體均購自美國Abcam 公司；LEICA ASP200S自動脫水機(德國)；LEICA EG1150H 組織包埋機(德國)；LEICA圖像采集分析系統(德國)。

1.3 分組及造模 30只Wistar 大鼠依據隨機數字表法分為假手術組、模型組及長春西汀組，每組10只，模型組及長春西汀組使用雙側頸總動脈永久性阻斷法(bilateral common carotid artery permanent occlusion，2VO)[6]制作大鼠慢性腦缺血模型。方法：大鼠術前12 h禁食、禁水，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，頸正中切開后，鈍性分離游離雙側頸總動脈，分別結扎其遠心端、近心端，從中間剪斷，以確保頸總動脈無血流通過，縫合切口，術后各組大鼠均在常規條件下飼養。假手術組以相同方法行頸前皮膚切開，分離、暴露但不結扎雙側頸總動脈，逐層縫合切口。長春西汀組于2VO術后 24 h內給予長春西汀10 mg/kg腹腔內注射，假手術組、模型組給予等量生理鹽水注射，共注射21 d。

1.4 觀察指標 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定各組大鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、TNF-α含量；使用免疫組化法檢測大鼠海馬區組織中勿動蛋白 (Nogo-A)、少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp)、髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)表達情況；采用免疫組化法結合圖像分析，檢測各組大鼠海馬CA1區腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達。

2 結 果

2.1 3組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較 模型組及長春西汀組腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手術組(P<0.05)，IL-10含量則均低于假手術組(P<0.05)；長春西汀組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量低于模型組(P<0.05)，IL-10含量則高于模型組(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠腦組織中IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較(±s) 單位：ng/mL

2.2 各組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達比較 假手術組及長春西汀組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達均低于模型組(P<0.05)；長春西汀組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達高于假手術組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達比較(±s)

2.3 各組大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達比較 假手術組及長春西汀組大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達均高于模型組(P<0.05)；長春西汀組大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達低于假手術組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達比較(±s)

3討 論

慢性腦缺血是臨床常見病，多發于中老年人群，主要臨床癥狀可表現為頭暈、視物不清、頭重等，嚴重時可造成病人神經功能損傷，對病人正常工作及身心健康影響極大[7]。慢性腦缺血病理過程復雜，是因慢性腦灌注下降導致腦功能障礙的臨床綜合征，相對于急性或亞急性腦缺血，其具有可干預時間窗較長的特點，如能早期診斷并積極治療，可有效阻斷疾病進展，降低腦血管相關事件發生的風險[8-9]。有研究表明，在腦灌流不足所誘發的系列級聯反應過程中，免疫炎癥反應可貫穿腦損傷的全過程[10-11]。而在多梗死灶型血管性癡呆及阿爾茨海默病病人外周血中，炎性因子含量均異常，表明炎性因子參與腦灌注不足所誘發的系列級聯反應過程[12]。另有實驗證實，腦缺血時內皮細胞炎癥反應使被激活的巨噬細胞、少突膠質細胞等釋放大量的IL-1β、TNF-α，從而激活促炎反應[10，13]。IL-1β、TNF-α在腦缺血損傷中的作用已有很多相關報道，而IL-10在腦缺血損傷中的作用報道相對較少。本研究對大鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、TNF-α含量進行檢測后發現，模型組及長春西汀組腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手術組(P<0.05)，IL-10含量則均低于假手術組(P<0.05)；長春西汀組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α 含量低于模型組(P<0.05)，IL-10含量則高于模型組(P<0.05)。表明長春西汀可抑制慢性腦缺血大鼠炎癥反應，有利于減輕缺血、缺氧對神經元的損害。中樞神經系統具有一定的再生能力，但軸突再生抑制因子可阻礙神經系統損傷后的神經功能恢復，而Nogo-A、OMgp及MAG 是機體主要的神經生長抑制因子，在慢性腦缺血時Nogo-A、OMgp及MAG表達明顯增強[14-15]。大腦海馬區CA1區神經保護因子對腦區神經元缺血損傷較為敏感，而BDNF通過與其受體TrkB的結合，啟動細胞內信號轉導途徑，發揮神經保護作用[16-17]。VEGF則通過與其受體 VEGFR2結合，發揮促進微血管生成及血管內皮細胞增殖作用，使受損病變區域血供恢復，進而修復受損神經元[18-19]。本研究結果顯示，模型組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG陽性表達最高，長春西汀組次之，假手術組則最低；假手術組及長春西汀組大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達均高于模型組(P<0.05)；長春西汀組大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達低于假手術組(P<0.05)。證實長春西汀對慢性腦缺血大鼠神經保護作用機制可能是通過抑制Nogo-A、OMgp及MAG過度表達，促進大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達來實現的。

綜上所述，長春西汀通過抑制慢性腦缺血大鼠炎性反應及大腦海馬區 Nogo-A、OMgp 、MAG 的表達，促進大鼠海馬CA1區BDNF及VEGF表達，從而發揮神經保護作用。