黃芪甲苷對缺血再灌注誘導的大鼠心肌細胞及線粒體自噬的調節作用機制研究

李旭陽,張東偉,趙宏月

(遼寧中醫藥大學附屬醫院沈本醫院內二科，遼寧 沈陽 110032)

心肌缺血再灌注損傷是心臟在經受較長時間的缺血后血液再灌注的一種不可逆的損傷，目前研究認為此病的發生會導致氧自由基異常增多、物質代謝改善、細胞內線粒體結構損傷和線粒體功能障礙等一系列的病理變化，上述病理變化相互影響，最終會導致心肌細胞發生凋亡作用[1-2]。目前臨床對于抑制線粒體過度自噬的干預藥物較多，但效果并不理想。黃芪甲苷屬于中藥黃芪的主要有效成分，也是黃芪多糖的主要成分，有研究表明[3]，黃芪甲苷可在一定程度上對糖尿病腎病腎臟起到保護作用，能夠通過內質網應激機制，一方面可抑制細胞凋亡，另一方面還可抑制炎癥反應。但目前臨床上對于黃芪甲苷對心肌線粒體自噬的影響機制并不完全明確，因此在本文研究中運用黃芪甲苷對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡以及線粒體自噬的影響，為臨床上黃芪甲苷的應用提供新依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：選取SPF級75只SD健康雄性大鼠，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，體質量220～250 g。所有大鼠均養殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養時間1周。本文研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

主要試劑：黃芪甲苷(液體狀；純度≥98%，南京春秋生物工程有限公司，CAS號：84687-43-4)；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體(上海信帆生物科技有限公司，貨號：XFC1532)、小鼠抗大鼠Bax抗體(上海科敏生物科技有限公司，貨號：DXT-STB12011)、小鼠抗大鼠Caspase-3抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：bs-0081R-1)，兔抗大鼠PINK1抗體(廈門研科生物技術有限公司，貨號：YKA-AF1830a)、兔抗大鼠Parkin抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：bs-1865R-1)、兔抗人p62抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，貨號：orb89844)、兔抗人LC3抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：K000467P)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥

選取75只大鼠,10只作為空白組，其余大鼠建立心肌缺血再灌注模型。參照吳宥熹等[4]研究實驗方法建立心肌缺血再灌注模型。在建模前所有大鼠均禁食，使用75 mg/kg的戊巴比妥鈉注射于大鼠腹腔行麻醉處理后采取仰臥位將大鼠固定于操作臺上，大鼠四肢插入針狀電極，之后使用標準Ⅱ導聯對大鼠心電圖進行記錄。連接小動物呼吸機，將大鼠胸骨左緣肌肉組織鈍性分離后將第四肋骨切斷后將心包膜剪開，暴露出冠狀動脈左前降支，之后使用無創縫合絲線在左心耳下方左前降支起始段下2～3 mm處進行進針處理，在動脈圓錐處進行出針處理，之后將左冠狀動脈左前降支行結扎處理以引起缺血，以Ⅱ導聯心電圖ST段明顯抬高大于0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結扎成功。在缺血處理后的30 min后，再灌注120 min，ST段下降為再灌注成功的標志。建模過程中2只大鼠死亡，4只大鼠因心電圖ST段無變化導致建模失敗，最終建模成功64只，將建模成功的64只大鼠分為模型組、低、中、高劑量組各16只。建模成功后，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠腹腔注射1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg的黃芪甲苷，每日1次，共干預1周，空白組和模型組不做任何處理。

1.2.2 病理組織學觀察

在給藥干預結束后隨機選取各組中1只大鼠采用斷頭法處死，取心肌組織，4%多聚甲醛進行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，脫水、透明，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學表現。

1.2.3 心肌酶檢測

在給藥干預結束后使用30 mg/kg的戊巴比妥鈉注射于各組剩余15只大鼠腹腔行麻醉處理，取腹主動脈血1 mL，3 000 r/min離心10 min，將血清分離出，之后使用ENCOREIO0型自動生化分析儀對各組大鼠乳酸脫氫酶(LDH)、心肌磷酸肌酸激酶(CK)以及谷草轉氨酶(AST)等心肌酶進行檢測。

1.2.4 心肌梗死面積檢測

在心肌酶檢測完成后隨機選取各組中3只大鼠采用斷頭法處死，迅速取大鼠心臟，行TTC染色以明確未梗死與梗死心肌，其中未梗死區為紅色、梗死區為白色，之后采用BI-2000醫用圖像分析系統計算大鼠心肌梗死面積。

1.2.5 心肌細胞凋亡情況、心肌細胞自噬體數量檢測

在給藥干預結束后隨機選取各組中6只大鼠采用斷頭法處死，迅速取大鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定24 h后行常規石蠟包埋，沿心臟橫軸連續切片，液氮中冰凍保存。其中3份使用TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡情況，另外3份檢測心肌細胞自噬體數量。心肌細胞凋亡情況檢測：取液氮中冰凍的切片行脫蠟處理，使用磷酸鹽緩沖液進行洗滌，之后將50 μL的TUNEL檢測液加入，在溫度為30 ℃的避光環境下孵育1 h，再次使用磷酸鹽緩沖液洗滌，在熒光顯微鏡下對心肌細胞凋亡數進行觀察計數，之后計算心肌細胞凋亡指數，心肌細胞凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100。心肌細胞自噬體數量檢測：使用電鏡觀察各組大鼠心肌細胞自噬體數量，取液氮中冰凍的切片使用枸櫞酸鉛、醋酸雙氧鈾行雙重染色，之后使用透射電鏡觀察各組心肌細胞自噬體結構，并拍照，使用計算1個銅網孔內自噬體數量，每個樣本計數3個銅網孔內自噬體數量，取平均值。

1.2.6 Bcl-2、Bax、Caspase-3、PINK1/Parkin通路蛋白檢測

使用Western blot檢測各組大鼠心肌線粒體中PINK1/Parkin通路蛋白表達量，在給藥干預結束后處死各組中剩余的6只大鼠，采用斷頭法處死，迅速取大鼠心肌組織，液氮冰凍后研磨，研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規蛋白提取，采取BCA法進行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過蛋白電轉到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST進行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Caspase-3、PINK1、PINK1、p62、LC3Ⅱ按照1∶1 000比例進行稀釋)，在4 ℃的環境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Caspase-3、PINK1、PINK1、p62、LC3Ⅱ按照1∶5 000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1h后再次洗滌，加入發光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。設置內參蛋白為GAPDH。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 病理組織學觀察

圖1為各組大鼠心肌組織病理變化觀察圖?？瞻捉M大鼠心肌纖維排列整齊，無炎性浸潤的發生。模型組大鼠心肌細胞增大，心肌纖維排列較為紊亂，間隙腫脹、增寬，心肌纖維缺損。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌纖維排列稍微規整，間隙腫脹現象消失，可見有橫縱紋，存在輕度的心肌纖維顆粒狀變性，且存在缺損、斷裂，細胞核呈現為圓形，但高劑量組大鼠心肌病理變化改善較為明顯。

圖1 各組大鼠病理組織學觀察圖(HE×200)

2.2 各組大鼠心肌酶水平比較

見表1。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清中CK、LDH、AST均高于空白組，具有統計學差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清中CK、LDH、AST均低于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；高劑量組大鼠血清中CK、LDH、AST均低于低劑量組、中劑量組，具有統計學差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠心肌酶水平比較

2.3 各組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡情況、心肌細胞自噬體數量比較

見表2、圖2。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數、心肌細胞自噬體數量均高于空白組，具有統計學差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數、心肌細胞自噬體數量均低于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；高劑量組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數、心肌細胞自噬體數量均低于低劑量組、中劑量組，具有統計學差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡情況、心肌細胞自噬體數量比較

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較(TUNEL×400)

2.4 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達量比較

見表3。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2表達量低于空白組，Bax、Caspase-3表達量高于空白組，具有統計學差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2表達量高于模型組，Bax、Caspase-3表達量低于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2表達量高于高于低劑量組、中劑量組，Bax、Caspase-3表達量低于低劑量組、中劑量組，具有統計學差異(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達量比較

2.5 各組大鼠心肌線粒體PINK1/Parkin通路蛋白表達量比較

見表4。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌線粒體PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ表達量均高于空白組，具有統計學差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌線粒體PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ表達量均低于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；高劑量組大鼠心肌線粒體PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ表達量均低于低劑量組、中劑量組，具有統計學差異(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌線粒體PINK1/Parkin通路蛋白表達量比較

3 討論

自噬是生物體生長發育中起著關鍵的自救行為，當線粒體發生自噬現象后可特異性識別細胞內損傷的線粒體，并可選擇性的將其清除，線粒體自噬在調控細胞內環境穩定、線粒體正常形態、功能等有著重要的作用[5]。有研究表明[6-7]，當心肌缺血再灌注發生后，在缺血階段心肌自噬水平顯著增加，而處于再灌注階段時自噬會被進一步的激活，雖然自噬能夠對損傷的細胞器、蛋白進行選擇性的吞噬清除來對細胞的正常結構和功能進行維持，但對于過度激活的自噬來說，此時的自噬會對細胞器進行過度的清除，進而加重心肌損傷程度。

缺血再灌注會引起心肌自噬體的異常增加，進而誘發自噬作用，將Caspase的級聯反應激活引發一系列的線粒體變化，之后將凋亡誘導因子釋放，最終促使心肌細胞發生凋亡[8-9]。Caspase家族屬于內切蛋白家族，可對細胞凋亡、炎癥起到調控作用，Caspase-3為Caspase家族中一個較為重要的因子，可反應出細胞凋亡情況，當其被活化后會對核酸內切酶、細胞骨架蛋白以及降解DNA修復酶起到激活作用，最終對細胞凋亡進行調控[10-11]。Bcl-2家族參與調控細胞凋亡，包括促凋亡、抑凋亡蛋白，促凋亡、抑凋亡蛋白之間的平衡可對細胞正常的凋亡進行維持，但當其失衡后則會雙向調節細胞凋亡，Bcl-2可在一定程度上對線粒體中的促進凋亡蛋白起到抑制作用，進而阻止細胞內的細胞色素c對Caspase家族的激活作用[12-14]。本文結果顯示，心肌缺血再灌注模型大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達量與空白組相比均呈現為異常的表達，但使用黃芪甲苷治療的大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白異常表達狀態得到改善，但運用高劑量的黃芪甲苷治療的大鼠上述蛋白水平改善程度更為明顯，此結果說明，黃芪甲苷可在一定程度上改善凋亡蛋白的異常表達，進而抑制心肌細胞凋亡，且呈現為劑量依賴。

PINK1/Parkin通路為介導線粒體自噬的經典通路之一，當線粒體形態、結構發生損傷后，線粒體膜電位會下降，進而引起線粒體外膜聚集較多的PINK1蛋白，進而對Parkin蛋白進行激活，將位于細胞胞漿中的Parkin蛋白轉位至線粒體中，進而將p62召集至線粒體基質中，而當p62被召集至線粒體基質中后會和LC3相結合，介導線粒體自噬。LC3Ⅱ屬于一種線粒體自噬特異性的信號蛋白，是由LC3Ⅰ和PE泛素樣相結合形成的，可將自噬體數量反應出來[15-17]。當較為嚴重線粒體損傷發生時，會導致線粒體無法通過自噬維持細胞內穩態，進而引起自噬發生紊亂，在一定程度上對線粒體中的促凋亡的蛋白起到抑制作用，進而阻止細胞內的細胞色素c對Caspase家族的激活作用[18-19]。目前臨床上已有研究[20]證實黃芪甲苷可調節心肌缺血再灌注大鼠線粒體自噬，但其研究并未明確其作用機制，本研究黃芪甲苷通過作用于PINK1/Parkin通路蛋白，調控通路蛋白以及凋亡蛋白的異常表達，進而抑制心肌細胞凋亡，改善線粒體自噬，證實黃芪甲苷可調節心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞及線粒體自噬，進一步明確了其作用機制，為臨床上黃芪甲苷的應用提供支持。

綜上所述，黃芪甲苷通過作用于PINK1/Parkin通路，共同調控自噬蛋白和凋亡蛋白，進而起到調節心肌缺血再灌注大鼠線粒體自噬，抑制心肌細胞凋亡的作用，且呈劑量依賴。