中藥復方脊髓康促進脊髓損傷大鼠神經功能恢復的實驗研究

邵陽 楊俊鋒 馬勇 徐辰 董赟 吳毛 王善付 殷杰 張素 王建偉

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)常見于嚴重脊柱外傷后，近些年數據顯示，其發生概率逐年上升。脊髓損傷的發生涉及到機體各個系統，且并發癥復雜、嚴重，治療療程長、所需費用高，效果也不甚滿意，目前也沒有有效方法可恢復脊髓損傷后的運動功能。因此，極高的致殘率、不理想的復健效果給自身及國家帶來了沉重負擔。傳統醫學在治療脊髓損傷方面，有較好的療效，中藥復方脊髓康是其中的代表制劑。研究發現，中藥復方脊髓康在能夠清除氧自由基、改善損傷局部的炎癥反應、調節其免疫應答、減少細胞凋亡，有效改善神經生長環境，促進脊髓神經元的再生[1-3]。

研究發現，通過調節星形膠質細胞(astrocyte，AS)，是目前促進脊髓損傷復健的熱點。當脊髓損傷發生時，AS相關的神經膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein，GFAP)高度表達，從而對神經再生產生物理屏障；活化的星形膠質細胞還可以分泌抑制性的細胞外基質分子如硫酸軟骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)等一大類蛋白多糖，抑制損傷后神經再生，從而對神經再生產生一種化學障礙，因此如何抑制星形膠質細胞，成為促進脊髓神經功能修復的關鍵。我們擬建立脊髓損傷大鼠模型，設立不同組別，研究中藥復方脊髓康對脊髓損傷大鼠神經功能恢復的影響，觀察GFAP在不同治療組中的表達程度。

1 材料與方法

1.1 大鼠及藥物制備

清潔級雌性SD大鼠，120只，體重220～300 g。無錫市血液病防治研究所提供，大鼠生產許可證：SCXK(蘇)2017-0007，適應性飼養7天。

中藥復方脊髓康為南京中醫藥大學附屬無錫附院的傳統經驗方(國家發明專利號：ZL200910026193.7)，實驗用藥由無錫市中醫醫院藥劑科煎制，分為高、中、低三種濃度湯劑(2.5 g/mL、1.25 g/mL、0.625 g/mL)。冷藏備用。處方：生黃芪30 g、丹參20 g、川芎10 g、赤芍12 g、當歸尾12 g、水蛭10 g、蜈蚣1條、制大黃10 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、枳實10 g、厚樸10 g、肉蓯蓉10 g、淫羊藿10 g、地鱉蟲10 g、車前子包15 g、益智仁10 g。

1.2 實驗動物分組

共120只SD大鼠，隨機分配，共六組，每組20只(選取標本時、隨機挑選10只)。包括假手術組、模型組、脊髓康不同劑量組(高濃度、中濃度、低濃度)和強的松組。

1.3 模型制備

本方案采用改良Allen法打擊大鼠T9-T11節段脊髓。成功造模，可見大鼠脊髓局部組織充血水腫，下肢肌肉痙攣、抽動，直至癱瘓。所有實驗SD大鼠，積極預防感染，術后1～3天，予青霉素腹腔注射。加強護理，每日兩次按摩膀胱，促進排尿。加強觀察，預防術后并發癥、降低死亡率。

1.4 標本采集

各組大鼠分別于3天、7天、14天三個時間點組，進行標本采集。以脊髓損傷大鼠造模損傷區為中心，逐層切開、分離肌肉組織，取出病損區域脊髓組織，10 mm左右，免疫組化實驗取材后，放置于福爾馬林溶液4℃冰箱保存。RT-PCR實驗取材后，即刻送回實驗室，-70℃冰箱保存。

1.5 觀測指標

1.5.1 斜板實驗、肌力檢測評價 斜板實驗：將SD大鼠置于傾斜木板頂端，觀察其下落角度。以其能夠靜止于板上的最大角度為指標；隨機抽取3只SD大鼠，在規定時間點，完成斜板實驗測試。肌力：按改良的Tarlov標準評價脊髓損傷后肌力情況；分為五個等級：1分，大鼠后肢未見肌肉收縮；2分，大鼠后肢可見肌肉收縮，無關節活動；3分，后肢肌肉收縮、無法站立；4分，能站立，但行走不能；5分，大鼠后肢肌力正常。各組大鼠術前均為5分。隨機抽取3只SD大鼠，在規定時間點，完成肌力測試。

1.5.2 免疫組化法觀察GFAP的表達 按照實驗步驟，取得各時間點標本，行組織梯度脫水、浸蠟、包埋等處理。行標本切片，隨機選取3份樣本用于檢測。對切片洗滌、加入抗體、增強、復染等相關操作后，運用高倍顯微鏡觀察染色的陽性表達情況。

1.5.3 RT-PCR法測定脊髓組織中GFAP mRNA表達 由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物設計并合成，經BLAST引物驗證并預實驗檢測，熔解曲線均為單一峰形，未見其他峰值。具體序列見表1。

表1 基因序列表

由相關公司進行引物設計并合成，根據熒光定量PCR試劑盒說明書，按照qRT-PCR反應體系加樣、操作，按兩步法進行PCR反應程序。以管家基因GAPDH作為內參基因，分析GFAP在脊髓組織中的相對表達量。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 中藥方對SCI大鼠斜板實驗數據的影響

實驗結果表明，脊髓損傷大鼠經中藥復方脊髓康治療后，術后第7天起脊髓康(中、高劑量組及強的松組)斜板實驗數據較模型組明顯增加(P<0.05)。第14天各給藥組大鼠斜板實驗數據較模型組明顯增加(P<0.05)，中藥各劑量組治療效果與強的松組相似。見表2。

表2 各組大鼠脊髓斜板實驗數據

2.2 中藥復方脊髓康對脊髓損傷大鼠雙后肢神經功能評分的影響

實驗結果表明，脊髓損傷大鼠經中藥復方脊髓康治療后，術后第7天及第14天雙后肢神經功能評分較模型組明顯增加(P<0.05)，治療效果與強的松組相似。其中中藥復方脊髓康中等劑量組與強的松組在術后第3天時的評分較模型組增加(P<0.05)，低劑量及高劑量組未見明顯差別。見表3。

表3 各組大鼠雙后肢神經功能評分分)

2.3 免疫組化法觀察GFAP蛋白的表達

假手術組鏡下觀察，發現AS散在分布，未見明顯肥大、增生，形態正常。模型組鏡下觀察，可見神經纖維損傷，AS反應性活化明顯，視野下密集分布，形態肥大。與模型組相比，強的松組視野下觀察到的AS活化明顯受到抑制，數量較少，但形態存在變化，肥大、增生。觀察中藥組可見活化的AS較少，與強的松組相比，星形細胞有部分肥大。見圖1。

注：本組實驗結果僅表明脊髓康能夠發揮作用。具體組間差異并不明確，故中藥組僅選一組作為示例。

2.4 RT-PCR法測定脊髓組織中GFAP mRNA表達

術后各個時間點，模型組GFAP mRNA表達量最高，且與各給藥組的差異均有顯著統計學意義(P<0.05)，且隨著時間延長，在術后14天，模型組GFAP mRNA表達量達到頂峰，明顯高于其他組別(P<0.01)。與強的松組相比，脊髓康高、低劑量組GFAP mRNA相對表達量偏高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)，脊髓康中劑量組在術后3天，GFAP mRNA與強的松組相比未見明顯差異(P=0.064)。強的松組、脊髓康高、中、低劑量組在3天、7天、14天各時間點GFAP mRNA均呈動態表達，脊髓損傷3天時至最高峰，之后逐漸下降。見表4。

3 討論

脊髓損傷的發生涉及到機體各個系統，且并發癥復雜、嚴重，治療療程長、所需費用高，效果也不甚滿意，目前也沒有有效方法可恢復脊髓損傷后的運動功能。AS在體內一般存在形式有靜止與活化兩種。當SCI發生時，AS將由靜止態轉變為活化態?；罨腁S會促使下游部分脫氫酶同工酶活性將顯著增強，GFAP的表達水平也明顯升高，AS形態將顯著增大。當受到損傷、缺血等刺激時，AS將不斷有絲分裂，體積變大，數量增多，形成網狀結構。

表4 各組大鼠脊髓組織中GFAP mRNA表達鼠數3)

AS在脊髓損傷后的病理變化與以下情況有關：(1)接觸抑制作用減弱：細胞間相互接觸可以促進細胞周期素依賴性酶抑制劑P21蛋白的表達，同時可對pRb蛋白的磷酸化產生抑制作用，促使AS再次進入細胞周期。(2)高分子量葡萄糖胺聚糖透明質酸(HA)可以使AS保持在靜止態，對AS的增殖起到抑制作用；當SCI時，HA的降低會促使AS的繼發性增長。(3)脊髓損傷位置的AS還可經旁分泌、自分泌細胞因子來促使自身增殖。AS在白介素21B、睫狀神經營養因子的刺激下將會由靜止態轉變為活化態；然后在成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-α等的作用下進入到細胞周期；再通過腫瘤壞死因子-γ、腫瘤壞死因子-α等作用形成膠質瘢痕。(4)黏蛋白C不僅能增值AS，也能一直AS，但未活化AS在長期作用下，會自行活化。

目前，AS已成為脊髓損傷治療、修復神經元的潛在重要靶點之一。脊髓損傷后病損區域神經元持續生長、神經功能有效恢復的關鍵點，總結起來有以下幾方面：(1)能夠提供神經元生長的底物；(2)具有促進病損區域神經元生長的相關因子；(3)抑制膠質瘢痕增生形成所造成的屏障阻隔[4-6]。主流觀點認為[7-11]，脊髓損傷后病損區域星形膠質細胞形成的“物理性屏障”及“化學系屏障”，是阻礙神經元再生及神經功能恢復的關鍵元兇?；诖死碚摚罅繃鴥葘W者對中醫藥展開研究，以此明確其對于星形膠質細胞的作用及意義。因此，如何調控AS，同時減輕繼發性脊髓損傷，是脊髓損傷后神經功能恢復的突破口之一[12-14]。

大量針對GFAP的研究已經明確了其作為AS活化的代表性產物，能夠反映膠質細胞活化程度。而CSPG因其能夠改善局部微環境，改善繼發性脊髓損傷，而同樣受到關注。研究發現，脊髓損傷后，脊髓損傷區域內可見CSPG表達上升[15-16]，治療后感覺與運動功能恢復效果與之密切相關。鞠躬等[17]研究發現，在脊髓損傷后，CSPG是阻礙神經修復的關鍵因素，CSPG會結合周圍不同細胞外基質，抑制神經再生。有學者采用干細胞移植、鞘內注射硫酸軟骨素酶ABC等多種手段[18-19]，降低CSPG的表達，可明顯改善脊髓損傷預后，促進運動功能恢復。目前研究報道大多認為，CSPG導致的繼發性神經功能受損由糖胺聚糖鏈介導[20]。因此，去除糖胺聚糖鏈或可促進功能康復。

我們對造模大鼠進行研究，設立實驗組及對照組，研究中藥復方脊髓康對星形膠質細胞的作用效果及其內在機制。發現星形膠質細胞活化的標志行產物，GFAP在脊髓損傷區域呈強陽性表達，這一病理變化符合既往研究結果。

此次研究證實，中藥復方脊髓康能夠促進脊髓損傷大鼠運動及感覺功能的恢復，隨著中藥濃度的增加，其療效有增加趨勢。針對脊髓損傷大鼠脊髓損傷區域取材，行免疫組化及RT-PCR，可以明確大鼠脊髓損傷后損傷區域GFAP表達明顯增高。在進行藥物干預后，脊髓康各組及強的松組在GFAP表達上明顯低于模型組，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；脊髓康組內各時間點比較，可以發現脊髓康中等劑量組在療效上優于低劑量組及高劑量組，因此掌握合適的濃度也是提高療效的關鍵點。

綜上所述，中藥復方脊髓康能夠促進脊髓損傷大鼠斜板實驗和雙后肢神經功能評分改善；通過免疫組化及RT-PCR法觀察，脊髓康組和激素組都能抑制GFAP表達，控制膠質瘢痕形成，減輕脊髓損傷后繼發性損傷。