植物乳桿菌CCFM8610對去卵巢大鼠骨質疏松癥的改善作用

彭江，翟齊嘯，于雷雷，田豐偉，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

骨質疏松癥是以骨量減少和骨的微觀結構退化為特征，導致骨的脆性增加以致易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。其嚴重后果是導致骨折，嚴重危害中老年人尤其是絕經后婦女的健康[2]。目前治療骨質疏松的藥物一類是抑制骨吸收，另一類是促進骨形成。這些藥物均有各自的代謝特點及適用人群，有的藥物還伴隨一些特殊的不良反應[3]。因此尋找安全有效的具有改善骨質疏松癥的物質已經成為重要的研究方向。研究發現，骨質疏松與腸道健康密切相關[4]，腸道微生物可通過調節腸道菌群、腸道免疫因子、腸道屏障等進一步影響骨骼免疫狀態、改變血清素，皮質醇和性激素的代謝，從而打破骨形成和吸收之間的平衡[5-6]。無菌小鼠與臨床實驗研究發現腸道菌群對骨代謝具有重要影響[7]，利用抗生素、微生態制劑調節腸道菌群后也進一步影響了骨量水平。

大量動物實驗結果顯示，特定益生菌株如鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillusrhamnosus，LGG)、副干酪乳桿菌、長雙歧桿菌等可減少腸道和骨骼的炎癥，改善腸道通透性并防止骨質流失[8-10]。同時，混合益生菌制劑如VSL#3等可緩解腸道和骨骼的炎癥，促進緊密連接蛋白的表達，降低腸上皮通透性，抑制骨質流失[11]。另外，臨床實驗表明羅伊氏乳桿菌可以減輕老年女性骨質疏松[12]。膳食補充益生菌可能對骨骼健康有益，具體機制包括：(1)通過調節RANKL，CD4T細胞和促炎性細胞因子來調節破骨細胞的功能和分化，以及通過修飾Wnt10b，IGF-1和OPG的表達來調節成骨細胞[13]；(2)通過調節腸道菌群和增加有益菌(如雙歧桿菌和乳桿菌)來預防局部腸道炎癥和通透性，改善骨骼健康[13]；(3)增加代謝產物如短鏈脂肪酸的水平，部分增強腸道和骨骼中鈣的吸收和信號傳導[14]。

本課題組前期從發酵蔬菜中分離得到1株益生菌(植物乳桿菌CCFM8610)，已證明其具有良好的鎘吸附、抗氧化以及耐酸耐膽鹽特性；同時能緩解細胞氧化應激、調節細胞的免疫應答、抑制細胞凋亡并保護細胞活性。該菌株還具有保護宿主腸道屏障、減少腸道通透性、緩解腸道氧化損傷、調節腸道免疫系統、促進宿主細胞代謝等功效[15-17]。這些對腸道健康的調節特性都表明該菌株具備緩解骨質疏松的功能潛力。本研究通過雙側卵巢摘除大鼠建立骨質疏松模型，探討了植物乳桿菌CCFM8610對去卵巢大鼠骨質疏松癥的改善作用，為益生菌防治絕經后骨質疏松癥提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS培養基，國藥集團化學試劑有限公司；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase 5, TRACP5)酶聯免疫吸附測定試劑盒、大鼠I型膠原交聯羧基端肽(cross linkedC-telopeptide of type I collagen, CTX-I)酶聯免疫吸附測定試劑盒、大鼠胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)酶聯免疫吸附測定試劑盒、大鼠內毒素(endothelin, ET)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細胞介素6(inter leukin-6,IL-6)酶聯免疫吸附測定試劑盒ELISA Kit,南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 灌胃菌株的制備菌株

乳桿菌菌株保存于添加30%(體積分數)甘油的MRS培養基中，保存溫度為-80 ℃，菌株在實驗使用前，連續活化3次，將菌液8 000×g離心10 min，去上清液，用滅菌生理鹽水將菌泥洗滌3次，重懸菌泥于質量濃度為120 g/L的脫脂乳粉溶液中，-80 ℃冰箱保存。使用前將菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至109CFU/mL備用。

1.3 動物實驗設計

本研究采用的是購自上海斯萊克公司的SPF級健康SD雌性大鼠15只，12周齡，體重為(250±20)g。飼養溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±10)%，小鼠自由飲食，采用國家標準嚙齒類動物飼料飼養。動物實驗具體開展時間：2018-04-10—2018-06-10。將雌性SD未交配大鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組，每組5只。去卵巢組大鼠以3.3 mL/kg體量的10%(體積分數)水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹部常規消毒，腹部正中切口打開腹腔，切除雙側卵巢后，分2層縫合切口；假手術組只進行腹部切口，切除卵巢周圍部分脂肪組織，不摘除卵巢，其余操作同上。術后連續3 d按2×104U/100 g體量注射青霉素抗感染。

術后3周將存活者按體重隨機分組，15只雌性SD大鼠隨機分為3組：空白組、模型組、菌干預組，菌干預組灌胃對應的菌懸液(1×109CFU/mL)灌胃體積均為1.5 mL/d，空白組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每天1次，連續灌胃3周。實驗期間大鼠自由飲水，攝食標準飼料，每周稱量1次大鼠體重。

1.4 大鼠骨相關性指標的測定

1.4.1 大鼠股骨結構性指標的測定

統一將各組大鼠左側股骨從長徑中點鋸斷，將股骨遠心端按要求置于micro CT上，測定其距髁間窩約4 mm附近干骺端的骨密度(bone mineral density, BMD, g/cm3)、骨礦含量(bone mineral content, BMC, g)、骨體積分數(bone volume fraction, BV/TV, %)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th, mm)以及骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp, mm)。

1.4.2 大鼠血清骨代謝指標的測定

將收集到的大鼠血液放置2 h，3 000×g離心15 min后獲得血清，參照相應ELISA試劑盒說明書進行實驗，根據標準曲線計算血清中IGF-1、TRACP5、CTX-I。大鼠血清中Ca、P、Mg、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量均利用全自動血清生化分析儀進行測定。

1.4.3 股骨組織病理學觀察

取大鼠股骨左側同一位置的組織，用質量分數為10%的多聚甲醛溶液固定后，經過脫鈣、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色后，在切片掃描儀下切片觀察。

1.5 大鼠腸道中緊密蛋白基因表達量和內毒素的測定

參照過往文獻報道的方法[18]，提取大鼠結腸部位總RNA，反轉錄合成cDNA，最后對腸道中緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-1的mRNA表達水平將進行實時定量聚合酶聯反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)分析。血清中ET的含量測定采用酶聯免疫分析法，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.6 大鼠血清炎癥因子指標的測定

血清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達水平均采用ELISA試劑盒檢測。

1.7 統計與分析

數據采用GraphPad Prism 6和SPSS進行統計和分析，采用T檢驗進行組間兩兩比較(independent-samples T-test)進行分析，采用單因素方差分析檢測多組數據(One-Way, ANOVA)，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠常規生理指標的影響

大鼠在麻醉后1 h時左右開始逐漸蘇醒，手術當天精神稍差，活動量少，飲水攝食均較少，術后第1天逐漸恢復，術后第3天正常飲水進食，手術傷口恢復較好，術后24 h后切口無紅腫。傷口裂縫，可正常活動。術后72 h后切口無明顯感染征象，手術1周后切口完全愈合，縫線脫落。手術后體重顯著增加，連續3周給大鼠灌胃植物乳桿菌CCFM8610，干預組大鼠的體重增加幅度趨于正常，與對照組差異不顯著。

2.2 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠骨結構和代謝指標的影響

由表1可知，手術后，經3周恢復、3周灌胃干預，再次行同一部位骨密度檢測。結果顯示，模型組大鼠股骨骨密度、骨礦含量、骨體積分數、骨小梁厚度和骨小梁分離度與空白對照組比較，明顯降低，表明骨質疏松模型形成。而植物乳桿菌CCFM8610干預后，大鼠骨結構性指標均有顯著性升高(P<0.05)。由圖1-a～圖1-c可知，與空白組比較，模型組的血清IGF-1顯著降低，血清CTX-I顯著性升高。與模型組比較，干預組的血清TRACP和CTX-I水平明顯降低，而CTX-I水平顯著升高。由圖1-d、圖1-e可知，與空白組相比，單純造模組大鼠S-Ca、S-P、S-Mg濃度都顯著性下降(P<0.05)；骨形成的指標ALP顯著增加(P<0.01)，植物乳桿菌CCFM8610干預后，ALP顯著下降(P<0.05)，而S-P、S-Mg濃度均得到顯著恢復。如圖1-f觀察大鼠股骨切片HE染色圖顯示，空白組大鼠股骨骨小梁厚度均勻，結構清晰，細胞數量豐滿。而模型組老鼠切除卵巢1個月后股骨骨小梁明顯稀疏，孔隙率增加，局部有較大的空隙形成，骨細胞減少，骨小梁之間間隔明顯寬大，部分骨小梁有斷裂，提示模型組大鼠松質骨不僅存在骨量的丟失，還存在結構的破壞，符合骨質疏松癥組織形態學的表現。而植物乳桿菌CCFM8610干預后，干預組骨組織形態較模型對照組改善，但與空白組比，仍稀疏，骨小梁面積減少，存在斷裂骨小梁。

表1 植物乳桿菌CCFM8610對骨質疏松大鼠股骨結構指標的影響Table 1 Effects of L.plantarum CCFM8610 on the femoral structure indexes in ovariectomized rats

2.3 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠腸道屏障的影響

由表2可知，去卵巢手術顯著下調了結腸的細胞緊密連接相關蛋白基因相對表達量，導致了大鼠腸道物理屏障破壞，隨著腸壁通透性增加，腸腔內有害菌和抗原入侵結腸組織，加劇結腸損傷和炎癥反應。而相較于模型對照組，植物乳桿菌CCFM8610組ZO-1、ZO-2、Claudin-1和Occludin相對表達量均發生了上調，其中對Occludin和ZO-1相對表達量的上調程度相較于模型對照組高達2倍，如圖2所示，去卵巢后，內毒素顯著上升(P<0.05)，而植物乳桿菌CCFM8610的攝入，顯著降低了內毒素含量。具體來看，模型組的ET是(45.23±4.05) EU/mL，干預組的ET是(36.03±4.22) EU/mL，2組存在顯著差異(P<0.01)。

圖2 植物乳桿菌CCFM8610對骨質疏松大鼠血清內毒素變化的影響Fig.2 Effects of L.plantarum CCFM8610 on serum ET levels in osteoporotic rats

2.4 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠血清炎癥因子指標的影響

IL-6和TNF-α兩個指標屬于炎癥促進因子，由表3可知，模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量顯著高于假手術組。經3周連續植物乳桿菌CCFM8610灌胃，兩者血清含量得到明顯降低。

表3 植物乳桿菌CCFM8610對骨質疏松大鼠血清中IL-6和TNF-α濃度的影響Table 3 Effects of L.plantarum CCFM8610 on IL-6 and TNF-α concentrations in serum of ovariectomized rats

3 討論

去卵巢大鼠現已成為研究絕經后骨質疏松的經典動物模型[19]。骨重建過程是成骨細胞介導的骨形成作用和破骨細胞介導的骨吸收作用相偶聯的動態平衡過程[20]。骨的形成是通過成骨細胞的功能活動來實現的，在成骨細胞生長、分化和成熟的每個階段都能分泌不同的蛋白或細胞因子，作為其特征性標志物。TRACP是反映骨質破壞狀態的常用指標[21]。CTX-I是反映骨吸收的特異性指標之一，在破骨細胞功能活躍，骨吸收速率異常增快的情況下，才會有大量的I型膠原溶解和I型膠原交聯羧基末端肽排泄入血，并最終經腎臟排出[22-23]。本實驗通過雙側卵巢切除術建立骨質疏松癥大鼠模型，從骨密度、骨代謝和血清細胞因子等方面探討了植物乳桿菌CCFM8610對去卵巢大鼠骨質疏松癥的改善作用并對其作用機制進行初步探索。結果發現植物乳桿菌CCFM8610能夠顯著調節去卵巢大鼠骨代謝水平，增加骨密度并增強其骨吸收，緩解骨破壞性能，能顯著改善去卵巢大鼠骨質疏松癥。

我們將CCFM8610對去卵巢骨質疏松的緩解歸因于以下兩方面。一方面，RAEHTZ等[24-25]提出，雌激素缺乏會增加腸道通透性，從而降低屏障完整性。具體而言，雌激素缺乏導致緊密連接蛋白數量的轉錄水平降低，例如Claudin-2,-3和-15，以及JAM3，它們都被證明可以調節腸屏障的完整性[26-27]。此外，在動物實驗中，雌激素缺乏的小鼠血清內毒素水平升高，腸屏障滲透能力受損。這些研究表明，由雌激素缺乏引起的腸道通透性增加導致進入上皮黏膜下層的抗原負荷增加，從而影響免疫細胞的活化和破骨細胞生成細胞因子的局部產生[28]。本研究表明去卵巢手術會導致腸屏障受損，致病菌產生過量內毒素，導致腸道生態失調。而植物乳桿菌CCFM8610可通過改善腸道緊密連接蛋白表達的降低、修復腸上皮屏障受損，同時降低去卵巢引起的內毒素增加，進而阻止腸道內毒素泄露，改變宿主腸道菌群組成、恢復其多樣性和穩態來抑制骨吸收。過往研究發現，乳酸菌可通過各種生理調節機制提高宿主腸道的屏障功能。具體機制是：(1)從物理屏障的角度，益生菌可通過保護緊密連接蛋白ZO-1及Occludin，避免細胞骨架F-actin的重排，提高腸黏膜的完整性，并促進腸道上皮細胞的代謝活性[29]；(2)從化學屏障的角度，益生菌可促進腸道上皮細胞分泌包括MUC2、MUC3在內的黏蛋白，從而抑制致病或有害微生物對腸黏膜的黏附[30]；(3)從免疫屏障的角度，益生菌可提高外周血白細胞及腹膜巨噬細胞的吞噬活性并調節IFN-γ表達，促進腸道的特異及非特異性免疫[31]；(4)從微生物屏障的角度，益生菌可通過產生有機酸、細菌素等調控宿主腸道微生態的結構與組成[32]；從而保護腸道屏障。

另一方面，炎癥因子在骨質疏松癥的發病過程中發揮重要作用[33]。TNF-α作為腫瘤壞死因子家族的一員，是重要的破骨細胞激活因子，其可直接刺激破骨細胞前體細胞的增殖分化[34]，也可通過抑制破骨細胞凋亡延長破骨細胞的存活時間[35]。IL-6是反映骨丟失的重要信號，由成骨細胞及單核/巨噬細胞合成并分泌，可直接促進破骨細胞的增殖分化，刺激骨吸收[36]。IL-6和IL-6受體在骨質疏松癥的發病過程中有重要作用[37]，絕經后骨質疏松癥患者體內IL-6的mRNA水平明顯高于正常絕經婦女[38]。實驗結果表明，植物乳桿菌CCFM8610顯著降低了骨質疏松癥大鼠血清炎癥因子活性，提示其能通過降低TNF-α等炎癥因子的水平抑制破骨細胞活性。大量研究發現，益生菌的免疫調節活性成分主要是細胞壁、胞外多糖、代謝物；其調節機體的免疫主要是通過抑制核因子-κB以及絲裂原活化蛋白激酶代謝通路；益生菌刺激腸道分泌黏液、增強黏膜的穩定性以及調節吞噬細胞的吞噬能力與分泌細胞因子的能力，提高宿主的非特異性免疫能力[39]。此外，益生菌還能通過Toll樣受體信號通路刺激巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞分泌相關細胞因子，介導輔助型T細胞0(T helper cell 0，Th0)分化成Th1、Th2、Th17和Treg細胞，同時刺激宿主體內B淋巴細胞的增殖分化，產生IgA、IgG等免疫球蛋白，調節宿主的特異性免疫能力[40]。

綜上，本研究表明植物乳桿菌CCFM8610可通過調節宿主免疫系統及腸道屏障緩解去卵巢大鼠的骨質疏松癥，為開發預防骨質疏松的有效膳食干預方案提供了新的思路。