富含乳酸菌的脫腥海參肽粉的制備

汪韜，溫運啟，于嬌，薛勇，薛長湖

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

海參作為我國“海產八珍”之一，具有高蛋白、低脂肪和低糖的特點，其富含人體所需的氨基酸、維生素、脂肪酸和微量元素等營養物質[1]。同時，海參中含有的海參多糖、海參皂甙具有抗腫瘤、增強免疫等功效[2-5]。目前，海參的加工方法主要有鹽漬、鹽干、糖干、淡干和凍干等。由于傳統干制海參存在泡發工藝復雜、耗時長等問題[6]，因此研究人員基于方便、速食和大眾化的優點開發出多種海參速食產品，例如即食海參、海參果凍、海參膠、海參口服液等[7-9]。

海參肽的腥味是影響海參肽類產品接受度的重要因素，其腥味去除方法主要包括吸附、掩蓋、包埋等物理方法。盡管，這一類方法能夠對海參腥味發揮一定作用，但仍有不足。其中，吸附法會造成一定的海參原有風味的缺失以及海參多肽17.51%～50.81%的損失[10]，掩蓋法和包埋法會使得海參成分占比較低，且產品貯藏一段時間后存在返腥現象[11-12]。研究表明，乳酸菌發酵法對牡蠣的去腥和風味提升具有良好的效果[13]，同時乳酸菌具有調節免疫力、降低膽固醇以及改善腸道等功效[14-15]。因此，本文探究了乳酸菌發酵法對海參酶解液去腥和風味的影響，并通過冷凍干燥技術制備了富含乳酸菌的海參肽粉制劑，旨在為海參的精深加工和產品開發提供一定的理論依據和科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽漬海參，青島市南山水產市場；鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌，中國工業微生物菌種保藏管理中心；MRS肉湯、MRS瓊脂，青島海博生物科技有限公司。

NaCl、NaOH(均為分析純)，蔗糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉、VC、食用甘油(均為食品級)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺，蘇州蘇泰凈化設備工程有限公司；GHP-9270恒溫培養箱，蘇州國飛實驗室儀器有限公司；料理機，小熊電器股份有限公司；IKA渦旋混合器，德國IKA有限公司；Agilent 7980A GC氣相色譜-質譜聯用儀，安捷倫科技有限公司；Delta1-24 LSC plus冷凍干燥器，德國Marin Christ公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海參酶解液的制備

將鹽漬海參洗凈，用去離子水浸泡脫鹽，置于4 ℃條件下，每12 h換1次水，浸泡3 d。去除海參的沙嘴，洗凈，斬拌，加入去離子水至固形物含量為15%。煮沸10 min，殺滅初始微生物。加入20 mg/g枯草桿菌蛋白酶，在50 ℃下，酶解5 h。然后用60目篩網過濾，濾液在90 ℃水浴10 min滅酶，然后急速冷卻至4 ℃滅菌。得到滅菌海參酶解液。

1.3.2 發酵液的制備

將鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌分別用MRS肉湯培養24 h，活化2代，然后第3代培養48 h。第3代在4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min。沉淀用無菌生理鹽水清洗2次，然后菌液沉淀用滅菌酶解液配制成濃度為107CFU/mL的發酵液，4 ℃條件下備用。

1.3.3 乳酸菌發酵單因素實驗

通過單因素實驗，以風味感官得分為評價指標，考察發酵時間、蔗糖添加量、接種量對發酵液的影響。

1.3.4 正交試驗

按照因素的影響程度，選擇發酵時間、蔗糖添加量及接種量為主要影響因素，進行正交試驗。其他條件為鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種比例為3∶1，乳粉添加量為3%(質量分數)，發酵溫度為37 ℃。

1.3.5 凍干和貯藏

在酶解液中加入質量分數為0.5%的谷氨酸鈉、0.5%VC和1%食用甘油復合使用作為凍干保護劑[16-17]，進行凍干得到粉劑，測定凍干樣品的乳酸菌濃度，以未加凍干保護劑的樣品為對照，按照公式(1)計算存活指數。將制得的粉劑分別常壓塑封和真空塑封，包裝好的粉劑分別于4 ℃和25 ℃條件下貯藏。即得到4 ℃常壓、4 ℃真空、25 ℃常壓和25 ℃真空這4種貯藏條件下的樣品，每2個月測定樣品中乳酸菌濃度。

(1)

式中：Y，乳酸菌存活指數；k0，對照組樣品中乳酸菌濃度，CFU/g；k1，凍干樣品中乳酸菌濃度，CFU/g。

1.3.6 風味感官評定

由8位感官評定員組成，主要以樣品的組織狀態、腥味、風味和口感為評價指標。去掉每種樣品的最高分和最低分，取平均分作為樣品的感官值[18]，如表1所示。

1.3.7 理化指標測定

酸度(吉爾捏爾度)按照鮮乳的檢驗中酸度的測定方法測定[19]；菌落計數按照GB4789.35——2016中方法測定乳酸菌含量[20]。

表1 感官評價表Table 1 Sensory evaluation form

1.3.8 頂空固相微萃取結合氣質聯用分析揮發性成分

樣品前處理：取海參酶解液發酵前后的樣品置于20 mL頂空瓶中，于60 ℃下平衡5 min后，用固相微萃取針萃取40 min。

氣相色譜-質譜聯用條件：色譜柱為HP-INNOWAXS毛細管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流速1 mL/min，分離比5∶1；進樣溫度為250 ℃；升溫程序為起始溫度40 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質譜條件：EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍30～500m/z。

2 結果與分析

2.1 海參酶解液發酵單因素實驗

以感官值為判定指標、酸度值為參考指標，探究發酵時間、加糖量和接種量對海參發酵液的影響。由圖1-a可知，隨著發酵時間的延長，感官值呈先上升后下降的趨勢，在發酵時間為7 h時達到最大值，且酸度值隨著發酵時間的延長而升高。這表明發酵是一個持續產酸的過程，在發酵7 h時糖酸比達到一個較優值。而持續發酵因產酸過多，使得感官值降低。由圖1-b可知，隨著加糖量的增加，感官值和酸度值都呈現先上升后下降的趨勢，感官值在加糖量為3%達到最高。這表明加糖量在一定范圍內有利于乳酸菌的發酵，產生較好的風味，而加糖量過高時，會對乳酸菌的生長有一定的抑制作用，使得產酸不夠，樣品偏甜，感官值下降。由圖1-c可知，隨著接種量的增加，感官值和酸度值先上升后下降，感官值在接種量為4%時最高。這表明在一定的接種量條件下，乳酸菌在指數生長期內產酸量和糖分達到了一個較好的糖酸比，使得感官值較好。而接種量過高時，由于乳酸菌在指數增長期內的大量繁殖使得產酸量過高，從而降低感官值[21]。

a-發酵時間；b-加糖量；c-按種量圖1 發酵時間、加糖量和接種量對發酵感官值的影響Fig.1 Effects of fermentation time, sugar content and inoculation amount on sensory value

2.2 海參酶解液發酵工藝正交試驗

根據單因素實驗結果，選擇發酵時間(A)，蔗糖添加量(B)，接種量(C)為3因素，設置3水平，以感官評價值為指標，采用正交試驗進行發酵條件優化，根據極差分析法來確定發酵最佳條件。實驗結果如表2所示，通過極差分析可知，各因素對海參酶解液風味提升的影響大小依次為蔗糖添加量>發酵時間>接種量。由K值可知，最佳組合為A2B3C2。由表2感官評價值可知，最佳組合為A3B3C1。經驗證，組合A2B3C2的感官評價值為83.62分，高于組合A3B3C1的得分(81.75分)。故發酵最優組合為A2B3C2，即發酵條件為發酵時間7 h，蔗糖添加量為4%(質量分數)，菌液接種量為3%。

表2 正交試驗表Table 2 Orthogonal test table

2.3 海參酶解液發酵前后風味成分分析

經過正交試驗優化后的發酵工藝制得的海參酶解發酵液，通過感官值可知其腥味較海參酶解液明顯降低，且有益風味有了明顯提升。本研究采用頂空固相微萃取法結合氣質聯用法測定發酵前后海參液的揮發性風味成分及變化。表3為發酵前后揮發性化合物的歸屬、占比及氣味特點。采用頂空固相微萃取結合氣質聯用法對發酵前后的海參酶解液進行風味分析。結果表明，發酵前和發酵后的揮發性化合物分別為28種和39種。且發酵前后，海參酶解液中揮發性風味成分總相對含量分別為44.12%，50.39%。發酵前呈不愉快氣味的揮發性化合物有10種，占總揮發性風味成分相對含量為12.65%，呈愉快氣味的揮發性化合物有18種，占總揮發性風味成分相對含量為31.46%。發酵后呈不愉快氣味的揮發性化合物有6種，占總揮發性風味成分相對含量為6.36%，呈愉快氣味的揮發性化合物有33種，占總揮發性風味成分相對含量為44.03%。經過對比，呈不愉快氣味的揮發性化合物占比由發酵前的12.65%降低為發酵后的6.36%。呈愉快氣味的揮發性化合物占比由發酵前的31.46%上升為發酵后的44.03%。其中，經過發酵還產生了辛酸、癸酸、棕櫚酸、己醛、庚醛、反-2-辛烯醛等15種呈愉快氣味的揮發性化合物[22]，并且2-氨基丙烷、十五烷、2,6,10,14-四甲基十五烷、2,5-二叔丁基酚和吡啶這5種呈不愉快風味的揮發性化合物經過發酵后消失[23]。

表3 海參酶解液發酵前后揮發性化合物的歸屬、峰面積比例及氣味特點[22-24]Table 3 Attribution, peak area ratio and odor characteristics of volatile compounds before and after fermentation of sea cucumber enzymatic hydrolysate

2.4 海參酶解發酵液的凍干及貯藏

將海參發酵液加入凍干保護劑凍干后，以未加凍干保護劑的發酵液作為對照，測定乳酸菌的存活率及乳酸菌濃度，并測定貯藏期間海參凍干粉中的乳酸菌濃度。由圖2可知，相對于未加凍干保護劑，添加凍干保護劑的海參發酵液經過凍干后乳酸菌含量為對照組的1.9倍。凍干后得到的粉劑中乳酸菌濃度為6.54×1010CFU/g、海參質量分數為54%的粉劑。且該凍干粉劑初始乳酸菌含量和市售益生菌固體飲料基本一致。將添加保護劑的凍干粉劑分別置于4種不同條件下貯藏。由圖3可知，粉劑的活菌數在貯藏期呈下降趨勢，且不同貯藏條件之間存在顯著差異。采用4 ℃真空貯藏的活菌存活率在3個月后降為67.58%，為最優貯藏條件，且貯藏3個月后活菌數仍遠高于企業標準中的1×106CFU/g[25]。

圖2 添加凍干保護劑后凍干效果對比Fig.2 Comparison of lyophilization effect after adding lyophilization protection agent

圖3 海參肽凍干粉貯藏過程中乳酸菌存活率Fig.3 Survival rate of lactic acid bacteria during storage of sea cucumber peptide lyophilized powder

3 結論

綜上研究可知，通過乳酸菌發酵海參酶解液可以很好去除海參酶解液的腥味，同時提升風味。在發酵時間7 h，蔗糖添加量4%(質量分數)，菌液[V(鼠李糖乳桿菌)∶V(嗜酸乳桿菌)=3∶1]接種量3%時達到最佳發酵效果，此時海參發酵液風味最佳。且頂空固相微萃取結合氣質聯用結果表明，海參酶解液中呈不愉快氣味的化合物占比由發酵前的12.65%降為發酵后的6.36%，呈愉快氣味的化合物占比由發酵前的31.46%上升為發酵后的44.03%。這表明乳酸菌發酵減少了海參酶解液的不良風味物質，還能產生風味良好的物質。通過凍干制得的海參粉劑含海參質量分數為54 %，乳酸菌濃度為6.54×1010CFU/g，且乳酸菌活性較好。該粉劑能同時滿足消費群體對海參和乳酸菌的攝入，且風味較好。因此，該海參發酵液制備的粉劑具有開發為富含乳酸菌的海參固體飲料的潛力，也可用于咀嚼片、海參酸奶發酵劑等產品中。