LncRNA ZBTB20-AS1靶向miR-132-3p/MAPT軸影響阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展

李文玲 陳伯華 徐新 王靜 吉順莉 高捷 殷曉芹 孟相營

(南通大學 1附屬醫(yī)院藥劑科,江蘇 南通 226001;2附屬瑞慈醫(yī)院藥劑科)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性記憶喪失和認知功能障礙為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病，約占所有癡呆病例的60%〔1〕。AD的病理學改變包括淀粉樣病變、細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、小膠質(zhì)細胞活化和大量神經(jīng)元死亡〔2〕。據(jù)統(tǒng)計，2015年全球約3 500萬人患有AD，已造成嚴重的社會和經(jīng)濟負擔〔3〕。但AD發(fā)病機制尚不明確，且至今也未發(fā)現(xiàn)有效的AD治療藥物和策略。長鏈非編碼(Lnc)RNA是一類新型的非編碼RNA，具有廣泛的生物學調(diào)控和修飾功能〔4〕。近年來，LncRNA在AD中的作用逐漸被揭示。LncRNA早期B細胞因子3反義RNA(EBF3-AS)在AD患者的腦組織中表達異常，具有促進AD模型細胞凋亡的作用〔5〕；LncRNA核富集轉(zhuǎn)錄本(NEAT)1通過靶向miR-107可加劇β淀粉樣蛋白對AD神經(jīng)元的損傷〔6〕。李蒙蒙〔7〕采用基因芯片技術篩選AD差異表達LncRNA發(fā)現(xiàn)，lncRNA鋅指蛋白ZBTB20反義RNA1(ZBTB20-AS1)在AD細胞模型中表達上調(diào)，但ZBTB20-AS1在AD進展中的作用尚未可知。β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35可引起神經(jīng)毒性和氧化應激，其誘導的神經(jīng)細胞損傷是研究AD的常用模型〔8〕。本研究旨在闡明ZBTB20-AS1在AD進展中的作用和分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y購于美國ATCC；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國Hyclone公司；青鏈霉素溶液、噻唑藍(MTT)試劑盒及膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；Aβ25～35購于美國Sigma公司；si-con、si-ZBTB20-AS1、miR-con、miR-132-3p mimics、si-MAPT、pcDNA-con、pcDNA-MAPT、WT-ZBTB20-AS1、MUT-ZBTB20-AS1、WT--MAPT、MUT-MAPT的設計和構(gòu)建由廣西銳博生物科技有限公司提供；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及有關定量PCR試劑盒購于大連Takara生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；兔源MAPT抗體、兔源細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、兔源活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3抗體、鼠源β-actin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗均購于美國Abcam公司；增強型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)和處理 采用胎牛血清含量為10%、青霉素含量為100 U/ml和鏈霉素含量為100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的濕化細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)SH-SY5Y細胞。采用20 μmol/L的Aβ25～35處理SK-N-SH細胞構(gòu)建AD細胞模型〔7〕。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行細胞轉(zhuǎn)染。將生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞按照每孔2×105個細胞的密度接種于6孔板，利用LipofectamineTM2000將si-con、si-ZBTB20-AS1、miR-con、miR-132-3p mimics、si-MAPT分別轉(zhuǎn)染至生長匯合度為50%的SH-SY5Y細胞，轉(zhuǎn)染48 h檢測轉(zhuǎn)染效果，進行細胞活力和凋亡情況檢測。為進一步證實ZBTB20-AS1調(diào)控miR-132-3p/MAPT軸參與對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞活力和凋亡的調(diào)控，將si-ZBTB20-AS1分別與anti-miR-132-3p、anti-miR-con、pcDNA-MAPT或pcDNA-con分別共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞，經(jīng)Aβ25～35處理后，檢測SK-N-SH細胞活力和凋亡情況。

1.3實驗分組 實驗分為以下幾組：NC組、Aβ25～35組、Aβ25～35+si-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組、Aβ25～35+miR-con組、Aβ25～35+miR-132-3p組、Aβ25～35+si-con組、Aβ25～35+si-MAPT組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+anti-miR-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+anti-miR-132-3p組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+pcDNA-con組和Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+pcDNA-MAPT組。NC組為正常培養(yǎng)的SK-N-SH細胞。

1.4RT-qPCR檢測 采用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，測定其濃度和純度。為檢測ZBTB20-AS1和MAPT的表達水平，利用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；為檢測miR-132-3p，使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄；采用TB Green Fast qPCR Mix在ABI7900進行熒光定量PCR擴增。用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。ZBTB20-AS1和MAPT的檢測以β-actin為內(nèi)參，miR-132-3p的檢測以U6為內(nèi)參。引物序列(5′-3′)：ZBTB20-AS1上游引物TTAGCCATTGTACAGTTTGTGAAA，下游引物TCCTGAGGACTTTTGCTTGTCA；MAPT上游引物CCAAGTGTGGCTCAT TAGGCA，下游引物GCAATGTTGGACTGGACTCTGT；β-actin上游引物：GAAGTGTGACGTGGACATC-C，下游引物CCGATCCACACGGAGTACTT；miR-132-3p上游引物GCAACGTAACAGTC-TACAGCC，下游引物CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA；U6上游引物CTCGCTTCGGCAG-CACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.5雙熒光素酶報告基因檢測 Starbase在線預測顯示，ZBTB20-AS1和MAPT的3′-UTR含有miR-132-3p的結(jié)合位點。猜測ZBTB20-AS1和MAPT與miR-132-3p之間存在靶向調(diào)控關系并進行驗證。將miR-132-3p mimics和miR-con分別與野生型熒光素酶報告基因載體WT-ZBTB20-AS1(或者WT-MAPT)和突變型熒光素酶報告基因載體MUT-ZBTB20-AS1(或者MUT-MAPT)共轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集各組細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進行熒光素酶活性檢測。

1.6MTT法檢測細胞活力 將SH-SY5Y細胞按照每孔2×104個細胞的密度接種于96孔板，按照1.3實驗分組進行干預處理后，每孔加入20 μl的MTT試劑(5 mg/ml)室溫下孵育4 h，棄去培養(yǎng)基后，每孔加入150 μl的DMSO，室溫孵育2 h，當結(jié)晶完全溶解后，使用酶標儀測定490 nm波長處各孔的吸光度值。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集按照1.3實驗分組進行干預處理的SH-SY5Y細胞，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞2次，隨后加入1倍結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度。取100 μl細胞懸液(細胞數(shù)約為1×105)加入流式管內(nèi)，室溫避光條件加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻10 min，加入5 μl的PI，室溫避光孵育5 min后，補加1倍結(jié)合緩沖液至500 μl，混勻后，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8Western印跡檢測 采用預冷的PBS液洗滌按照1.3實驗分組進行干預處理的SH-SY5Y細胞，RIPA裂解緩沖液SH-SY5Y細胞，12 000 r/min離心5 min，采用BCA試劑盒對細胞上清液中總蛋白進行定量。取適量細胞蛋白與上樣緩沖液等體積混合，經(jīng)煮沸變性后直接上樣至凝膠加樣孔進行十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離細胞蛋白。利用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)至將細胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入已稀釋的MAPT抗體、CyclinD1抗體、Cleaved-caspase-3抗體、β-actin抗體4℃孵育過夜，然后與HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，利用增強型化學發(fā)光試劑盒進行顯影，放于X光膠片暗盒內(nèi)曝光后，圖像處理軟件分析目的條帶的灰度值。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA ZBTB20-AS1、miR-132-3p和MAPT在AD細胞模型中的表達 表1和圖1顯示，與NC組比較，AD細胞模型(Aβ25～35組)中LncRNA ZBTB20-AS1、MAPT mRNA和MAPT蛋白的表達水平顯著升高，miR-132-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)。

表1 AD細胞模型中LncRNA ZBTB20-AS1、MAPT和miR-132-3p表達量

2.2LncRNA ZBTB20-AS1靶向調(diào)控miR-132-3p表達，miR-132-3p靶向調(diào)控MAPT表達 ZBTB20-AS1的3′-UTR和miR-132-3p存在部分連續(xù)互補配對的核苷酸序列，MAPT的3′-UTR和miR-132-3p存在部分連續(xù)互補配對的核苷酸序列，見圖2。表2顯示，與miR-con和WT-ZBTB20-AS1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-132-3p mimics和WT-ZBTB20-AS1共轉(zhuǎn)染組SK-N-SH細胞對的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-con和MUT-ZBTB20-AS1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-132-3p mimics和MUT-ZBTB20-AS1共轉(zhuǎn)染組SK-N-SH細胞對的熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表3顯示，與miR-con和WT-MAPT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-132-3p mimics和WT-MAPT共轉(zhuǎn)染組SK-N-SH細胞對的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-con和MUT-MAPT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-132-3p mimics和MUT-MAPT共轉(zhuǎn)染組SK-N-SH細胞對的熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示，miR-132-3p是ZBTB20-AS1的靶基因，MAPT是miR-132-3p的靶基因。

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-132-3p和MAPT的靶向關系

A：starbase對miR-132-3p和LncRNA ZBTB20-AS1結(jié)合進行預測；B：starbase對MAPT和miR-132-3p結(jié)合進行預測圖2 LncRNA ZBTB20-AS1靶向調(diào)控miR-132-3p表達，miR-132-3p靶向調(diào)控MAPT表達

表2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CZBTB20-AS1和miR-132-3p的靶向關系

2.3沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及miR-132-3p和MAPT表達的影響 與NC組比較，Aβ25～35組SK-N-SH細胞ZBTB20-AS1和MAPT的表達水平顯著升高，miR-132-3p的表達水平顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白的表達水平顯著升高，CyclinD1蛋白的表達水平顯著降低，細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與Aβ25～35+si-con組比較，Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組SK-N-SH細胞ZBTB20-AS1和MAPT的表達水平顯著降低，miR-132-3p的表達水平顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白的表達水平顯著降低，CyclinD1蛋白的表達水平顯著升高，細胞增殖活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4、圖3。提示沉默ZBTB20-AS1可促進miR-132-3p表達，抑制MAPT表達，促進SK-N-SH細胞增殖，抑制Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞凋亡。

表4 沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

1～4：NC組、Aβ25～35組、Aβ25～35+si-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組圖3 沉默ZBTB20-AS1對AD細胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3和MAPT蛋白表達的影響

2.4過表達miR-132-3p對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及MAPT表達的影響 圖4和表5顯示，與NC組比較，Aβ25～35組SK-N-SH細胞miR-132-3p和CyclinD1的表達水平顯著降低，MAPT和Cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高，細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與Aβ25～35+miR-con組比較，Aβ25～35+miR-132-3p組

表5 過表達miR-132-3p對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

SK-N-SH細胞miR-132-3p和CyclinD1的表達水平顯著升高，MAPT和Cleaved-caspase-3的表達水平顯著降低，細胞增殖活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。提示，過表達miR-132-3p可抑制MAPT表達，促進SK-N-SH細胞增殖，抑制Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞凋亡。

1～4：NC組、Aβ25～35組、Aβ25～35+miR-con組Aβ25～35+miR-132-3p組圖4 過表達miR-132-3p后各組Western印跡檢測MAPT、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.5沉默MAPT對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響 表6和圖5顯示，與NC組比較，Aβ25～35組SK-N-SH細胞MAPT和Cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高，CyclinD1的表達水平顯著降低，細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與Aβ25～35+si-con組比較，Aβ25～35+si-MAPT組SK-N-SH細胞MAPT和Cleaved-caspase-3的表達水平顯著降低，CyclinD1的表達水平顯著升高，細胞增殖活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

表6 沉默MAPT對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡及相關蛋白表達的影響

圖5 Western印跡檢測MAPT、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.6抑制miR-132-3p表達可部分逆轉(zhuǎn)沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞的增殖和凋亡的影響 圖6和表7顯示，與Aβ25～35+si-con組比較，Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組SK-N-SH細胞miR-132-3p和CyclinD1的表達水平顯著升高，Cleaved-caspase-3的表達水平顯著降低，細胞增殖活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+anti-miR-con組比較，Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+anti-miR-132-3p組SK-N-SH細胞miR-132-3p和CyclinD1的表達水平顯著降低，Cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高，細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。提示，抑制miR-132-3p表達可部分逆轉(zhuǎn)沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞的增殖和凋亡的影響。

表7 抑制miR-132-3p表達可部分逆轉(zhuǎn)沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞的增殖和凋亡和相關蛋白表達的影響

1～4:Aβ25～35+si-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+anti-miR-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+anti-miR-132-3p組圖6 Western印跡檢測抑制miR-132-3p表達后各組細胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

2.7過表達MAPT可部分逆轉(zhuǎn)沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞的增殖和凋亡的影響 表8和圖7可見，與Aβ25～35+si-con組比較，Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組SK-N-SH細胞MAPT和Cleaved-caspase-3的表達水平顯著降低，CyclinD1的表達水平顯著升高，細胞增殖活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+pcDNA-con組比較，Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+pcDNA-MAPT組SK-N-SH細胞MAPT和Cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高，CyclinD1的表達水平顯著降低，細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。提示，過表達MAPT可以部分逆轉(zhuǎn)沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞的增殖和凋亡的影響。

表8 過表達MAPT可部分逆轉(zhuǎn)沉默ZBTB20-AS1對Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡和相關蛋白表達的影響

1～4:Aβ25～35+si-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+pcDNA-con組、Aβ25～35+si-ZBTB20-AS1+pcDNA-MAPT組圖7 Western印跡檢測MAPT、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

3 討 論

與李蒙蒙〔7〕研究結(jié)果相一致，本研究結(jié)果提示，ZBTB20-AS1的表達異常與AD的進展密切相關，這是首次關于ZBTB20-AS1基因功能的報道。

lncRNA作為與miRNA競爭性內(nèi)源RNA發(fā)揮作用是其最重要的調(diào)控機制之一。本文結(jié)果顯示miR-132-3p是ZBTB20-AS1的潛在靶基因。miR-132-3p隸屬于miR-132/-212簇，已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-132-3p參與調(diào)節(jié)突觸活性和可塑性〔9，10〕；miR-132-3p還可調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長，介導新生神經(jīng)元在成年海馬和齒狀回中的整合〔11〕；此外，miR-132-3p與突觸結(jié)構(gòu)形成和視覺皮質(zhì)可塑性有關〔12〕。本研究顯示，在AD模型細胞中miR-132-3p的表達水平顯著降低，與前人miR-132-3p在AD患者海馬區(qū)和前額葉皮質(zhì)表達下調(diào)的結(jié)論相吻合〔13，14〕。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-132-3p能夠減緩Aβ25～35對SK-N-SH細胞活力和凋亡的影響，ZBTB20-AS1可靶向負調(diào)控miR-132-3p表達，沉默ZBTB20-AS1通過靶向miR-132-3p可提高SK-N-SH細胞增殖活力，抑制Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞凋亡。

MAPT是神經(jīng)微管相關蛋白Tau的編碼基因，而Tau蛋白在神經(jīng)元中的堆積是AD公認的病理標志之一〔15〕。既往研究表明，AD患者血漿和腦脊液中Tau蛋白表達水平增加，Tau蛋白表達水平是預測AD的發(fā)生與進展的生物學標志〔16〕。本研究結(jié)果提示，沉默ZBTB20-AS1通過調(diào)控miR-132-3p/MAPT軸可拮抗Aβ25～35誘導的SK-N-SH細胞凋亡。然而，在未來研究中，ZBTB20-AS1在AD中的作用還需要進一步的體內(nèi)研究和臨床研究來證實。